今天跟大家分享的是Orbitrap Exploris™ 480的第1篇文献，作者是来自丹麦哥本哈根大学的Jesper V. Olsen教授，文中对Exploris 480联合FAIMS Pro的性能进行了全面测试，包括DDA与DIA鉴定，灵敏度测试，组织样品测试，磷酸化样品测试，以及TMT与DIA定量等。
 

　　文献总结：
 

　　DDA-FAIMS：单个FAIMS CV电压，500ng Hela 肽段，21分钟梯度可鉴定3473个蛋白；
 

　　DIA-FAIMS：单个FAIMS CV电压，500ng Hela 肽段，每分钟可鉴定2500条unique肽段，配合21分钟短梯度每天可分析60个样品，且每个样品定量超过5000个蛋白；
 

　　灵敏度测试：5分钟梯度，5ng Hela肽段中鉴定超过1000个蛋白；
 

　　组织特异性蛋白分析：12种大鼠组织样品中TMT及DIA定量超过10000个蛋白；
 

　　快速、灵敏、深度的磷酸化蛋白质组。
 

　　紧凑型四极杆-Orbitrap质谱仪
 

　　相比其它二合一的仪器，Exploris 480仪器是一个更紧凑更稳健的平台，且更易维护。该仪器与三合一系列中的Fusion Lumos及Eclipse有相同的离子源、接口，以及用户界面，因此可使用与三合一相同的前端选配件，包括FAIMS Pro接口以及内标校正EASY-IC源。同时，Exploris 480中的主动离子传输组件、四极杆、独立的电荷检测器以及多级离子通道组件均进行了全新的设计升级，提升仪器性能(图1)。
 

图1 Orbitrap Exploris™ 480仪器硬件示意图
 

　　DDA-FAIMS深度蛋白鉴定
 

　　扩大动态范围
 

　　样品：500ng Hela肽段
 

　　梯度：21分钟(60个样品每天)
 

　　鉴定结果：CV电压在-35V~-80V间，蛋白鉴定数目均高于不使用FAIMS，其中-75V时zui高，可鉴定3473个蛋白，比不使用FAIMS高出38%(图2A)。
 

　　图2A ：21min梯度，500ng样品，不同CV电压时DDA-FAIMS以及DDA的蛋白鉴定
 

　　动态范围：与不使用FAIMS相比，DDA-FAIMS不仅可覆盖更多的蛋白，还可覆盖更深的Hela蛋白丰度分布，即更高的动态范围(图2B)。
 

图2B：DDA-FAIMS及DDA与Hela深度蛋白组的蛋白丰度分布叠加图
 

　　梯度影响：与不使用FAIMS相比，随着梯度的缩短，-75V CV时的优势更加明显。采用100个和200个样品每天的梯度时，分别增加41%和48%的蛋白鉴定数目(图2C)。由于文中采用的梯度均很短，而CV电压的切换需要25ms，因此单个CV电压条件zui为合适。当梯度延长时，可通过不同CV电压组合的方式进一步提高蛋白组覆盖。
 

图2C：不同梯度时DDA-FAIMS与DDA的蛋白鉴定对比
 

　　DIA-FAIMS进一步扩大蛋白深度鉴定，增加蛋白定量精度
 

　　样品：500ng Hela肽段
 

　　梯度：21分钟(60个样品每天)
 

　　鉴定结果：DIA-FAIMS的*CV电压为-45V，可鉴定5138个蛋白，蛋白与肽段鉴定数目均高于不使用FAIMS时(图3A)，每分钟zui高可鉴定2500条肽段(图3B)。
 

　　图3A：21min梯度，500ng样品，不同CV电压时DIA-FAIMS以及DIA的蛋白鉴定；B：梯度中不同时间的肽段鉴定数目
 

　　定量精度：使用FAIMS时，71%的蛋白丰度在多次重复间CV值小于20%，54%的蛋白丰度CV值小于10%。而不使用FAIMS时，只有60%的蛋白丰度在多次重复间CV小于20%(图3C)。
 

图3C：DIA-FAIMS与DIA的多次重复蛋白丰度CV对比
 

　　极少量样品时的灵敏度测试
 

　　样品：5ng Hela肽段
 

　　梯度：5分钟(200个样品每天)
 

　　DDA结果：DDA只鉴定到26个蛋白，DDA-FAIMS实现10倍提升至281个蛋白(图4A)。DDA-FAIMS相比DDA更适用于极少量样品的分析，这是由于FAIMS可有效去除单价态的背景信号(图4C)。
 

　　DIA结果：DIA可鉴定547个蛋白，DIA-FAIMS可鉴定超过1000个蛋白(图4A)，且FAIMS可提升DIA的定量重现性(图4B)。
 

　　图4A：5min梯度，5ng样品在不同方法下的蛋白鉴定数目；B：DIA与DIA-FAIMS方法中重复间蛋白丰度CV小于20%的蛋白数目；C：DDA与DDA-FAIMS时的单价态母离子分布对比
 

　　组织特异性蛋白定量分析
 

　　样品：来源于12种大鼠组织的酶解肽段(图5A)
 

图5A：大鼠组织特异性图谱工作流
 

　　梯度：21分钟(60个样品每天)
 

　　组织特异性蛋白图谱：每个组织所含肽段各有不同，从骨骼肌中可鉴定50000条unique肽段，到睾wan组织中可鉴定到100000条肽段代表超过10000个蛋白(图5B，C)。该数据集含有213000条unique肽段，覆盖12909个蛋白编码基因，可用于进一步数据挖掘以及作为DIA的谱图库。
 

图5B：不同组织中的肽段鉴定数目；C：不同组织中的蛋白鉴定数目
 

　　TMT-11定量：数据采集使用Turbo-TMT方法，可在15000分辨率下分析TMT11标的样品。每次实验代表一只大鼠，均可定量超过8000个蛋白，总共定量超过10000个蛋白(图6A)。
 

　　DIA定量：不同组织分别进行数据采集，用对应组织的谱图库进行数据分析。蛋白组在不同组织间存在特异性，在睾wan组织中可鉴定超过5000个蛋白，肌肉组织中能鉴定约2000个蛋白。合并不同组织结果可定量超过8000个蛋白，与TMT的覆盖率类似(图6A)，且每分钟可鉴定超过600个蛋白(图6B)。
 

　　图6A：组织样品中DIA与TMT的蛋白及蛋白编码基因PCG的定量数目；B：两种方法每分钟定量的PCG数目
 

　　生物样品的重现性分析：分别使用TMT与DIA的数据对三个生物学重复进行主成分分析PCA。三个生物学重复在PCA图中距离接近，且小于不同组织之间的距离，这说明两种定量方式在生物重复间都具有高重现性(图6C，D)。
 

图6C：DIA定量的PCA结果；D：TMT定量的PCA结果
 

　　无监督层次聚类分析：DIA-FAIMS与TMT所得的蛋白表达谱十分类似，这说明这两种定量方法可提供类似的生物学信息(图6E)。
 

图6E：两种方法定量结果的无监督层次聚类结果
 

　　快速、灵敏、深度的磷酸化蛋白质组
 

　　样品：200μg Hela肽段经磷酸化富集，12个组织样品酶解肽段经磷酸化富集
 

　　梯度：21分钟(60个样品每天)
 

　　Hela样品：21分钟可鉴定超过8000条unique磷酸化肽段，其中超过5000条可靠定位至单个氨基酸上(图7A)。
 

图7A：200 μg Hela肽段经磷酸化富集后鉴定及定位的磷酸化肽段
 

　　组织样品：采用directDIA的方式，在12个组织样品中共鉴定到超过22000条unique磷酸化肽段，定位超过13000条磷酸化肽段(图7B)。
 

图7B：12个组织样品酶解肽段经磷酸化富集后鉴定及定位的磷酸化肽段
 

　　总结
 

　　Exploris 480联合FAIMS Pro适用于蛋白组学的各个方面，除了文中提到的DDA与DIA鉴定，极低量样品分析，组织样品，磷酸化样品，以及TMT与DIA定量等，还可实现BOXCAR-DDA，BOXCAR-DIA，SureQuant等定量工作
 

　　FAIMS可有效去除单价态的背景信号，可提高蛋白组覆盖，扩大动态范围，提高定量精度和准确性
 

　　TMTpro(TMT16标)将进一步提高TMT定量通量
 

　　全文链接
 

　　A Compact Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with FAIMS InterfaceImproves Proteome Coverage in Short LC Gradients
 

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