细胞介绍

　　该细胞系由PontenJ等建立，源于恶性神经胶质瘤。裸鼠皮下接种可成瘤。

　　细胞特性

　　1）来源：神经胶质瘤

　　2）形态：上皮样，贴壁细胞

　　3）含量：>1x106细胞数

　　4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

　　5)用途：仅供科研使用。

　　运输和保存：干冰运输及复苏好存活细胞：（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

　　细胞接收后的处理：

　　1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

　　2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

　　3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的*培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

　　4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后第，一次传代建

　　议T25培养瓶1：2传代。

　　一．培养基及培养冻存条件准备：

　　1）准备MEM培养基；优质胎牛血清，10%；2mML-谷，氨，酰，胺；NEAA1%双抗，1%。

　　注意事项：培养细胞的过程中细胞会发生堆叠和松散贴壁的细胞团这是正常的。需要2-3天对细胞进行一次换液以保证细胞的正常生长。该细胞贴壁较慢，复苏细胞后48h内尽量不要移动细胞让细胞达到最，佳的贴壁状态。生长过程中会悬浮细胞出现，在换液和传代过程中需要离心回收悬浮的细胞。丢弃悬浮的细胞会使细胞的密度变低，这个细胞在培养过程中不会达到100  %的融合。细胞生长过密会引起贴壁的细胞变成悬浮的状态。明胶或多聚赖氨酸包被的培养瓶可以使细胞更好的贴壁。

　　2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

　　3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

　　二．细胞处理：

　　1）冻存细胞的复苏：

　　将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL*培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，*培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml*培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

　　2）细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。该细胞轻微贴壁和悬浮培养的细胞，传代可以参考以下方法：

　　1.收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

　　2.加入0.25％（w/v）胰，蛋，白，酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

　　3.将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的*培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况1:2~1:5的比例进行。

　　3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；

　　1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×10

　　6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

　　3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

　　注意事项：

　　1.所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

　　2.建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意：冻存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。