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采用除磷脂板和LC-MS/MS法测定人血浆中*含量的快速方

时间:2020-11-10      阅读:111

科普关键词:“*”

*是二型糖尿病一线治疗中广泛使用的一种非处方药,在帮助预防与糖尿病相关的心血管疾病和癌症并发症方面具有良好前景。*的作用机理主要通过抑制肝葡萄糖的产生来降低高血压。随着二型糖尿病确诊数量的不断增多,预计*的使用量也将继续增加。*作为口服药的产品质量控制测试也因此显得尤为重要,以溶出度和相关生物等效性(BE)研究为代表的分析测试也需要寻求更加稳定高效的方法。

人血浆中*含量快速分析

*是一种高极性双胍分子,在血浆这样的复杂基质中可能会存在难以进行色谱分析的难题。与非药制药公司采取的常见生物等效性研究一样,我们将展示一种分析人血浆中*含量的快速方法,包括样品制备和LC-MS/MS分析。样品制备方法将采用Phree除磷脂板,并对该萃取方法的灵敏度、线性度、精密度、准确性和回收率进行评估。通过将蛋白沉淀和除磷脂相结合来制备样品。这种样品制备技术能非常有效地去除内源性的血浆蛋白和磷脂——这些物质会对分析柱的寿命以及MS检测中的离子抑制产生负面影响。本研究将采用核-壳Kinetex® 5 μm C18 50 x 4.6 mm分析柱进行快速的LC-MS/MS分析(不超过2分钟),该方法可为现代分析实验室节省大量时间。

实验条件

通过制备人血浆中浓度分别为1、2、10、50、100、500、1000、2000 ng/mL 的标准品来生成八个点构成的校准曲线(n=2)。制备8、800、1600 ng/mL 三种浓度的QC样品(n=6)(分别称为QCL、QCM和QCH)。然后按照下文中的样品萃取流程,采用Phree除磷脂96孔板(订货号:8E-S133-TGB)对上述标准品和QC样品进行萃取。

对于回收率测定实验,通过添加含有20 _L有效内标(IS)溶液的人血浆样品基质溶液来制备六份等效于 QCM(800 ng/mL *)的萃取前加标样品。然后按照样品萃取流程对上述样品进行处理。

在使用Phree萃取之后,样品氮吹之前,通过在含有20 μL有效内标(IS)溶液的人血浆空白样品中添加 800 ng/mL *的等效品来制备萃取后加标样品(回收样品,n=4)。

材料

标准品以及其它助剂和化学品均来自Sigma Aldrich。人血浆采购自BioIVT(纽约韦斯特伯里)。

结构

此图来自瑾宸科技

此图来自瑾宸科技

样品萃取流程

  1. 将50 μL人血浆样品加入13 x 100 mm试管中,加入20 μL有效内标(IS)溶液(含500 ng/mL*-d6的50:50乙腈水溶液)
  2. 向样品试管中加入500 μL乙腈,混合至少30秒
  3. 将样品放入Phree 96孔板上的一个未使用的孔中,并施加正压或负压(5mm Hg)。
  4. 使用2 mL的96深孔板(订货号:AH0-7194)来收集洗脱后的样品
  5. 在40°C的N2中干燥
  6. 用400 μL的2 mM醋酸铵水溶液重新定容
  7. 进样3 μL

分析方法

此图来自瑾宸科技

此图来自瑾宸科技

此图来自瑾宸科技

此图来自瑾宸科技

此图来自瑾宸科技

LC-MS条件:

分析柱:

Kinetex®5 μm C18

规格:

50 x 4.6 mm

货号:

00B-4601-E0

样品制备:

Phree™除磷脂96孔板

货号:

8E-S133-TGB

流动相:

A = 2 mM醋酸铵水溶液(pH值未调节)

B = 甲醇

等度:

A/B (95:5)

流速:

750 μL/min

进样量:

3 μL

温度:

40 °C检查:

MS/MS (SCIEX®4500 Triple Quad™) ESI 正离子模式HPLC系统:

Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)运行时间:

2 分钟

压力:

约 60 bar

结果与讨论

表1显示了SCIEX 4500(ESI正离子模式)使用的MRM Transitions 和数据采集的质谱参数设置。表2显示了迷你试验评估运行结果,展示了该试验的准确性和精密度。试验中使用了三种浓度的QC (QCL、QCM 和QCH),各QC样品的准确性和精密度分别为94.7 – 99.8 %之间,CV% 在0.72 -7.16%之间。表3给出的使用Phree除磷脂96孔板得出的中等浓度QC样品(QCM)的样品萃取回收率结果为67.6%,CV% 为4.06% (n=6)。1 ng/mL 定量下限和 2000 ng/mL定量上限的代表性色谱图分别如图1和图2所示。本方法的线性动态范围通过分布于 1-2000 ng/ mL 且线性度可接受(r=0.9999)的八个校准点测出,重复测试两次,校准曲线如图3所示。

使用Phree 96孔板来进行蛋白沉淀和除磷脂,可同时对多份样品进行处理,从而减少样品制备花费的时间。为进一步缩短样品分析时间,采用了短(50 x4.6 mm)Kinetex C18分析柱来将*分析物从样品制备阶段未*去除的残留样品基质干扰物中分离出来。

结论

对于新型非药而言,需要对多个患者样本的多个时间点进行分析,以便展示其生物等效性。为确保实验的有效性,采用高效的试验方法至关重要。在本技术说明中,我们展示了一种采用Kinetex C18 5μm,50 x4.6 mm分析柱的LC-MS/MS分析体系,其总试验运行时间仅为2分钟。此外,采用Phree 96孔板来进行样品制备也非常简单便利。Phree除磷脂板可提供非常清晰的萃取结果,更大限度地减少内源性磷脂和血浆蛋白产生的基质干扰物峰。此处展示的快速测定人血浆中*含量的方法非常适合于生物等效性研究。此处展示的快速分析方法可降低研究和生产环境中高通量分析的成本,且不会对分析效果产生任何不良影响。

艾杰尔-飞诺美为丹纳赫集团旗下品牌,产品涉及液相色谱柱、气相色谱柱、样品制备、分离纯化及制备仪器。品牌致力于持续以优质的产品,快速的技术响应和方法开发服务于各行业领域用户,助力提高的健康水平及幸福感。

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