小分子抑制剂通过和蛋白结合，抑制通路中节点蛋白，阻断通路信号传导，从而抑制肿瘤细胞生长。“堵”一个节点可以抑制肿瘤细胞，同时“堵”两个呢？研究者发现MEK抑制剂（Trametinib曲美替尼）和CDK4/6抑制剂（Palbociclib帕布昔利布）联用除阻断两个节点外，还引起肿瘤细胞发生其他的变化，触发了NK细胞，具体内容如下：

MEK抑制剂（Trametinib曲美替尼）和各种CDK4/6抑制剂联用体外活性（细胞、分子）都更好

在体内，Trametinib曲美替尼和Palbociclib帕布昔利布联用效果

药物联用体外抑制KP肺癌细胞的能力增强，在免疫功能正常的C57BL/6小鼠上，药物联用可显著延长荷瘤小鼠存活时间

在免疫缺陷NSG小鼠上，虽然药物联用抑制肿瘤生长作用增强，但无法显著延长存活时间，暗示免疫系统对药物疗效存在作用

开始看药物联用对免疫系统的影响，首先免疫细胞（CD45+）浸润增加

给药之后T细胞在浸润的免疫细胞中占比增加了，但T细胞的激活比例没有发生变化（+对应荷瘤小鼠，-对应无瘤小鼠）

看完比例看T细胞数，联用并没引起T细胞数的变化，暗示药物联用并没有选择性的激活T细胞

看完T细胞，再看NK，发现药物联用使得荷瘤小鼠NK细胞的浸润、激活都增加了

对药物联用后NK的变化进行了深度分析，发现药物联用后，NK为激活、成熟表型

药物联用并不影响无瘤小鼠（-）的NK细胞，暗示药物联用引起的NK细胞变化是肿瘤依赖的

正向的看到药物联用使得荷瘤小鼠存活时间延长，看到药物联用对NK浸润、激活的贡献，那两者存在关联吗？开始反向验证，用抗体敲掉NK之后，药物联用延长小鼠存活时间的能力显著下降，暗示药物联用延长小鼠存活时间是NK细胞依赖的

敲掉巨噬细胞或T细胞并不影响药物联用延长小鼠存活时间，佐证药物联用对NK细胞的选择性

前面发现药物联用对NK影响是肿瘤细胞依赖的（在无瘤小鼠上药物联用并不会促进NK的浸润和激活），说明是药物作用后，肿瘤细胞发生的某些变化选择性的把NK召集过来，所以开始观察药物作用后肿瘤细胞深层次的变化：CDK4/6通过促进RB磷酸化，解除RB的生长抑制作用，促进E2F调节的G1到S期转化，药物联用后RB磷酸化较单独使用Palbociclib显著降低，G1到S期转化受限，肿瘤细胞被阻滞在G1期

RB的磷酸化除了调节细胞周期，还可细胞衰老相关，而衰老又伴随引起免疫作用，因此作者测量了细胞衰老相关指标SA-β-gal，发现联合给药显著提高不同肿瘤细胞系衰老

单独给药组撤去药物后肿瘤细胞重新增殖，而联合给药组细胞不会重新增殖-细胞衰老停滞，这种联合给药引起的细胞衰老停滞是RB依赖的

分析药物干预后的肿瘤细胞基因表达发现，联合给药使细胞增殖相关基因表达降低、衰老相关基因表达提高

联合给药还使得肿瘤细胞一系列细胞因子表达升高，其中包括对NK细胞有召集作用的趋化因子CCl2、CCL4、CCl5、CXCL10等（作者进行了大量测序工作，见支撑文档，略）

联合给药后，粘附因子ICAM-1、NKG2D配体ULBP2/5/6、MICA在肿瘤细胞上表达显著提高，暗示NK对肿瘤细胞识别增多

联合给药使肿瘤细胞一系列NK可识别配体表达升高，暗示NK识别肿瘤细胞会增多，体外将NK和药物处理过的肿瘤细胞共培养发现，NK杀伤联合给药组肿瘤更多；阻断配体受体互作后对肿瘤细胞的杀伤显著减少

在体内，敲除NK后，衰老的肿瘤细胞明显增多，肿瘤生长不再受联合给药抑制，暗示NK细胞对联合给药诱导产生的衰老肿瘤细胞存在清除作用

确定了联合给药引起肿瘤细胞衰老，衰老“招”了NK之后，开始找肿瘤细胞内部和衰老有关联的通路，用shRNA沉默NF-κB亚单位p65后，药物对肿瘤细胞生长的抑制作用还在，但衰老相关因子表达出现了下调

尽管沉默NF-κB亚单位p65，抑制衰老，对药物直接抑制肿瘤生长的作用没有影响，但衰老受抑制后联合给药引起的NK对肿瘤细胞的杀伤显著降低（红色为NK，绿色为肿瘤细胞），暗示衰老相关因子对NK杀伤肿瘤细胞的必要性

在体内，衰老受抑制的肿瘤细胞（沉默NF-κB亚单位p65）联合给药后NK细胞对肿瘤的浸润不受影响，但联合给药引起的NK激活增加作用消失，暗示衰老相关因子对NK激活的必要性

找NF-κB引起的衰老因子中调节NK细胞杀伤肿瘤细胞的细胞因子：只有阻断TNF-α联合给药引起的荷瘤小鼠存活时间延长作用才显著减弱，暗示TNF-α是调节NK的关键因子

果然，阻断TNF-α后联合给药引起的NK激活降低，杀伤肿瘤的能力降低

前面用的体内模型是异位移植瘤，在自发瘤让做一遍：联合给药显著抑制肿瘤生长、延长小鼠存活时间，这一作用是通过诱导肿瘤细胞衰老，促进其分泌TNF-α、表达ICAM1，介导NK激活发挥的

细胞内部的信号通路是一张大网，纵横交错，小分子靶向药像一样精确打击，特异性破坏某一通路节点以阻断该通路从而抑制肿瘤细胞生长。这篇文章用两个分子同时卡住两个节点，除了靠自己打击肿瘤细胞外还招来了NK细胞“趁火打劫”，小分子抗肿瘤药直接向肿瘤细胞开炮，而肿瘤免疫是调动人体自身细胞向肿瘤发起进攻，这篇文章好，将两种策略建立了关联。

Marcus Ruscetti, Josef Leibold, Matthew J. Bott, Myles Fennell, et al. NK cell–mediated cytotoxicity contributes to tumor control by a cytostatic drug combination [J]. Science, 2018.

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