RTCA技术与MTT对比
时间：2020-11-09 阅读：259
1、向E-Plate检测板中加入培养基并测定背景阻抗值。
2、收集对数期细胞并计数，调整细胞悬液浓度，向E-Plate检测板中加入一定体积的细胞，室温超净台内放置30min。
3、将加入细胞的E-Plate检测板放入检测台上（检测台预先放入培养箱中），进行实时动态的细胞增殖检测。
4、过夜检测后，向各培养孔中加入配制好的梯度药物并继续进行实时动态检测， 即可获得化合物介导的细胞效应曲线及不同时间段IC50值。
RTCA实时无标记技术细胞增殖及毒性检测实验流程：
1、实验操作简单，步骤少，人为误差小。
2、采用无标记方法，不存在标记效率问题，并且对细胞无损伤，细胞在生理状态下进行检测，结果准确度高。
3、实验结果客观，重复性好，不需设置重复孔（实验操作需规范，如有特殊要求也可设置重复孔）。
4、因预先对基础阻抗值测定，所以无需设置空白对照孔。
5、完整细胞效应图谱，提供大量、重要的动态反应信息。
典型的利用RTCA技术获得的细胞增殖实验检测结果：
MTT法简介：
原理：MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
MTT实验步骤：
1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000个/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）。
3、加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况。
4、5% CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
5、每孔加入20ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
6、终止培养，小心吸去孔内培养液。
7、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
8、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
MTT检测结果：
RTCA技术与MTT优势对比：
| RTCA技术 | MTT |
标记物 | 无，对细胞无伤害 | 有，对细胞有伤害 |
实验数据 | 连续的实时动态曲线 | 终点检测（单点数据） |
实验步骤 | 简单 | 繁琐 |
实验重复性 | 高 | 低 |
实验数据获取 | 自动 | 手动 |
细胞活性信息 | 粘附、活力、形态 | 活力 |
时间量效检测 | 一次，同时获取 | 多次实验 |
数据准确性 | 高 | 低 |
实验耗时 | 短 | 长 |
检测过程 | 培养箱内进行（正常生长环境） | 培养箱外（非细胞生长环境） |
实验后的细胞样品 | 可用于其他细胞检测实验 | 只能丢弃 |
预测细胞毒性作用机制 | 可以 | 不能 |
动态IC50值 | 可以 | 不能 |
实验结果实例 |