导读
 

　　随着药物研发难度日益加大，分子结构的复杂性、生产工艺的发展都对分析技术提出了新的挑战。比如抗体/ADC 等生物制药复杂的结构异质性、多手性中心的对映异构体分子分离、生物药的连续流生产的在线过程分析(PAT)等，这些挑战都是常规一维色谱技术无法解决，或需要牺牲时间/人工成本和数据质量。
 

　　作为色谱分析领域的 Game Changer，二维液相能否帮我们克服这些挑战？二维液相能否从研发走向 QC？
 

　　本文将从 *0 制药*：瑞士 Roche(罗氏)、Novartis(诺华)和美国 Merck & Co (默沙东)、BMS(百时美施贵宝)发表的二维文献和相关讲座中，为您寻找这些问题的答案。
 

　　这些文献和讲座涉及以下应用方向：
 

　　-   单抗多 CQA 同时分析用于细胞株筛选；在线过程分析(PAT)
 

　　-   自动化单抗结构异质性表征-在线酶切
 

　　-   ADC 多 CQA 分析方法专属性验证
 

　　-   二维液相用于杂质质控可行性分析-基于 AQbD 的方法验证
 

　　-   多手性中心对映异构体分离
 

　　四大药企简介
 

　　Merck 和 BMS 虽然不是销售额排名靠前美国药企，但由于他们的 PD-1 单抗 K 药 Keytruda(Merck & Co)和 O 药 Opdivo(BMS)，成为当下被谈论多的两家企业。根据 EvaluatePharma 发布的 2021 医药市场展望，作为第1款 FDA 批准的 PD-1 单抗，BMS 的 O 药销售额将突破 88 亿美金，而*的K药将在2023年接棒阿达木单抗，成为新一代药王。[1]
 

　　Roche 和 Novartis 总部均位于瑞士巴塞尔，2019 年处方药销售* 1 和第 2 名(据 EvaluatePharma 统计)，而他们的发展轨迹确截然不同[1]。Novartis 起源于瑞士的汽巴、嘉基、山德士三家化工*，产品管线丰富。目前热门的嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)，Novartis 是拥有首FDA 批准的此类疗法。Roche 是制药*中生物制药占比高公司之一， 80% 以上销售额来自其Biotech产品。Roche 是会买的公司之一， Roche 的肿瘤药利妥昔单抗(美罗华)、曲妥珠单抗(Herceptin)、贝伐株单抗 (Avastin) 均出自其收购的基因泰克 (Genentech)公司[2]。
 

　　大分子
 

　　Merck & Co：单抗多 CQA 同时分析用于细胞株快速筛选
 

　　聚集体会影响单抗的生物效价、稳定性、安全性，因此聚集体分析是单抗生产工艺开发中常见的分析。快速的、无需前处理的分析方法将提高细胞株筛选、工艺优化的效率。
 

　　Merck & Co.与 Agilent Thought Leader (安捷伦思想奖) 获得者 Dwight R. Stoll 教授合作，基于 Agilent InfinityLab 2D-LC 的 ASM-MHC 模式(主动溶解调制多中心切割二维液相)开发了快速 Protein-A X SEC 二维方法，分析已收获的细胞培养液(harvested cell culture fluid samples)中目标单抗的滴度和聚集体；分析时间仅需5分钟。系统考察了方法的回收率、分离度、准确度、精密度，证明快速 Protein-A X SEC 二维方法是一个高效的、高通量的筛选工具。[3]
 

　　图 1. 测定 HCCF 中单抗聚集体含量的工作流程。快速 Protein-A X SEC 二维液相法无需手动 PAP 分离工作[3]
 

　　BMS：二维液相进行抗体生产在线过程分析(PAT)
 

　　在线过程分析(PAT)通过及时测量影响关键质量属性(CQA)的关键过程参数(CPP)来设计、分析和控制生产过程。PAT 可以增强对工艺和产品的理解，以确定设计空间，尤其是在连续流工艺中意义更加重大。PAT 有助于提高产品质量、批次间重复性、效率和灵活性，大化节约制造空间，优化工艺过程和稳定性，节约资本投入和运营成本。
 

　　对于结构异质性复杂的抗体类药物，传统方式进行 Pro-A 净化前处理，再进行聚集体、电荷异质性等色谱分析，无法满足在线、实时 PAT 的需求。BMS 的研究人员使用 SegFlow 与 Agilent InfinityLab 2D-LC 联用技术，实时在线分析生物反应器培养基氨基酸、单抗和融合蛋白类药物的滴度和关键质量属性，实现细胞培养过程的代谢平衡和调控。
 

　　图 2. Agilent 与 LCGC 邀请 BMS 专家举办的关于二维液相进行抗体生产在线过程分析(PAT)的讲座
 

　　Roche：自动化单抗结构异质性表征-在线酶切
 

　　通常 mAb 分子量大约 150Kd，IEC 分析电荷异质性时，如果直接完整蛋白除盐进入高分辨质谱，往往只能看到质量数变化比较大的异质性，但是对于质量数变化很小的变异(比如脱氨，分子量变化只有 1Da )，完整蛋白水平很难准确分析判断。
 

　　Roche 研发人员基于安捷伦液相模块搭建的“四维”系统(4D HPLC/MS)，可以对离子交换电荷异质体进行在线酶切肽图分析，能够清晰的看到脱氨基、氧化等 PTM 带来的电荷酸碱变异。[4]
 

　　4D HPLC/MS 在线除盐酶切系统：一维 IEC 分离 mAb 电荷异质体；二维反相捕获、还原；三维在线胰酶酶切；四维 Peptide Mapping 进入 MS 分析。
 

　　图 3. 4D LC/MS工作流程简图 [4]
 

　　Novartis – ADC 多 CQA 分析方法专属性验证
 

　　抗体偶联药物 ADC 发展至今，已经历了三代，近年来广受关注，2017-2020 共 8 个产品获批。ADC 药物的关键质量属性 CQA 包括：高分子量组分 HMWS，药物抗体偶联比 DAR，载药量分布，未偶联小分子药、连接子、连接子-小分子药含量等。
 

　　Novartis 研究人员开发了梯度 SEC 方法用于分离 ADC、高分子量组分 HMWS、未偶联小分子药、连接子、连接子-小分子药。并使用 Agilent InfinityLab 2D-LC 的 MHC 模式(多中心切割二维)进行了方法专属性验证，证明他们开发的梯度 SEC 方法的分离效果；同时研究了梯度 SEC 方法和 SEC X RPLC 方法的精密度和回收率；两者精密度均在 0.01%-3.68% 之间，回收率在 82%-107% 之间。[5]
 

　　图 4. ADC 药物的 SEC X RPLC 二维定量分析[5]
 

　　小分子
 

　　Merck & Co -小分子：多手性中心对映异构体分离
 

　　结构高度相似化合物的分离分析是现代药物的大挑战之一，比如对映异构体的分析。新开发的小分子药物绝大多数含有手性中心，而且多手性中心药物的开发也已成为一个新的趋势。多手性中心对映异构体，几乎不可能通过一根单一分离机制的色谱柱实现所有异构体的分离。
 

　　Merck & Co 研究人员使用 Agilent InfinityLab 2DLC 的 MHC 模式(多中心切割二维)研究单手性中心药物法华林和代谢产物羟基法华林的分离，使用反相X手性色谱柱的模式，在第1维实现原型和代谢产物的分离，第二维实现手性分离。使用 Agilent InfinityLab 2D-LC 的 Comprehensive 2D-LC 模式(全二维)，采用手性 X 手性色谱柱的模式，实现了多中心药物合成过程中异构体的分析。研究工作作为封面文章，发表在 Analytical Chemistry 杂志上。[6]
 

　　图5. Merck & Co 使用 Agilent InfinityLab 2D-LC 在 Analytical Chemistry 上发表的封面文章[6]
 

　　Genentech：二维液相用于 QC 的可行性
 

　　二维液相在分离上的优势有目共睹，但这种技术是否足够稳定，是否可以应用于 GMP 环境下的 QC 分析呢？
 

　　Genentech 使用安捷伦单中心切割二维液相，基于 QbD 理念，通过 DoE(实验设计)考察了关键方法参数 CMPs(中心切割的关键因素：进入 2D 的馏分组成(pH、有机相比例) 及 loop 环的填充比例)的设计空间 MODR 和操作空间 PAR，对关键方法属性 CMAs 进行验证，以证明二维在 GMP 环境中的质控可行性。[7]
 

　　图 6. 通过 QbD 软件进行二维分离三大关键变量设计空间的确认[7]
 

　　安捷伦二维液相方案，改变你的色谱分析
 

　　以上案例诠释了安捷伦二维液相方案在解决不确定性问题、复杂样品的完整信息、和复杂处理自动化等方面的优势。
 

　　安捷伦自 2012 年推出市场第1款商品化二维液相产品以来，一直在该领域持续创新。产品也被世界 TOP 药企广泛认可，并应用于药物研发工作。
 

　　资料下载
 

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　　参考文献：
 

　　[1] 2021医药市场展望
 

　　[2] Fiona Yu. 制药巨擘的成功密码——小故事，大策略，为你解读跨国药企背后的秘密. 药时代. 2020.
 

　　[3] Zachary D. Dunn, Jayesh Desai, Gabriel M. Leme, Dwight R. Stoll, and Douglas D. Richardson. Rapid two-dimensional Protein-A size exclusion chromatography of monoclonal antibodies for titer and aggregation measurements from harvested cell culture fluid samples. mAbs (Taylor & Francis Online), Volume 12, 2020 - Issue 1
 

　　[4] Gsto?ttner, C.; Klemm, D.; Haberger, M.; Bathke, A.; Wegele, H.;Bell, C.; Kopf, R. Fast and Automated Characterization of Antibody Variants with 4D HPLC/MS, Anal. Chem. 2018, 90, 3, 2119–212
 

　　[5] Alexandre Goyon, Luca Sciascera, Adrian Clarke, Davy Guillarme, Reinhard Pell. Extending the limits of size exclusion chromatography: Simultaneous separation of free payloads and related species from antibody drug conjugates and their aggregates. Journal of Chromatography A, 1539 (2018) 19–29
 

　　[6] Chandan L. Barhate, Erik L. Regalado, Nathan D. Contrella, Joon Lee, Junyong Jo, Alexey A. Makarov, Daniel W. Armstrong, and Christopher J. Welch. Ultrafast Chiral Chromatography as the Second Dimension in Two-Dimensional Liquid Chromatography experiments. Anal. Chem. 2017, 89, 3545−3553
 

　　[7] Samuel H. Yang, Jenny Wang, Kelly Zhang. Validation of a two-dimensional liquid chromatography method for quality control testing of pharmaceutical materials. J. Chromatogr. A 1492 (2017) 89–97
 

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