仪器网

　　【中国仪器网 行业应用】PCR 技术，即聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是由美国 PE Cetus 公司的 Kary Mullis 在 1983 年(1993 年获诺贝尔化学奖)建立的。其原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。即通过模拟体内DNA复制条件，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。
 

　　荧光定量PCR(qPCR)是PCR较为传统的PCR技术，经过多年的发展，已是很成熟的实验方案了。其中，常用的是Taqman法和SYBR Green法。而在这二种方法当中，Taqman法又以其特异性高、定量，得到广大用户的认可。
 

　　但事实上Taqman法荧光PCR还是一个相对定量的办法。它测的是一个Ct值，也就是PCR到第几个循环，荧光强度达到了一个设定值。要想用Taqman方法得到：样本中到底有几个目标基因的拷贝，那么还是要再做一个标准品的(qPCR)曲线。才能知道样本的Ct值落在标准曲线的哪个位置上。再进一步推算出样本中的拷贝数量。
 

　　这样做，它首先要做一个标准曲线，这样的话，一来增加了工作量，另一方面，因为引入了标准品，也会产生相应的误差，导致实验中又多引入了一个实验的误差变量。
 

　　科学家为了克服传统定量PCR的上述两个弱点，那么又新发明了微滴数字PCR。  数字PCR(Digital PCR-dPCR)技术是一种新的核酸检测和定量方法，与传统定量PCR(qPCR)技术不同，数字PCR采用定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。  由于这种检测方式具有比传统qPCR更加出色的灵敏度和特异性、性，dPCR迅速得到广泛的应用，这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面变现出的优势已被普遍认可，而其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景，已经受到越来越多的关注。  数字PCR在医学领域哪些研究方向发挥重要作用呢？小编盘点了以下11个研究方向。
 

　　1. 基因表达差异研究
 

　　检测时*不依赖传统的Ct值即可实现真正意义上的定量，从而提供了比实时荧光定量PCR更的基因差异表达研究，尤其对于那些靶基因表达差异微小的情况：microRNA、lncRNAs等的表达分析、等位基因的不平衡表达、单细胞基因表达分析、Exosome内核酸分子定量分析等。
 

　　2. 拷贝数变异(CNV)研究
 

　　微滴化的样品处理及检测，这种摆脱Ct值的计算方法而直接获取目标基因的拷贝数，为拷贝数变异的研究提供了的检测精度。是其他诸如二代测序、芯片杂交等平台无法达到的，因此采用数字PCR能够有效对NGS、aCGH的实验结果进行验证，并具有成本低、通量高的特点。
 

　　3. 低丰度及稀有序列的定量
 

　　目前对于低丰度目标序列的检测，定量PCR、杂交、毛细管测序及NGS等方法都因受到背景DNA的干扰，使得检测灵敏度及性都达不到精细定量的要求(如定量PCR检测中Ct值大于33的情况下，其重复性就不是很高)， 而微滴式数字PCR系统通过核心的微滴化处理，使得稀有的核酸序列从大量的背景DNA中分离出来，从而提高了检测的灵敏度及重复性。
 

　　此外，由于样品微滴化处理的同时，也将样品中可能存在的抑制剂进行了分装，提高了数字PCR扩增对于抑制剂的耐受程度，因此可具体应用于很多临床样品(血液、尿液、粪便、痰液、脑脊液等)中对肿瘤核酸标记物的检测。一般而言，毛细管电泳和定量PCR的检测灵敏度约在10%;NGS的灵敏度可达到1%;而ddPCR的检测下限为0.001%。
 

　　4. 甲基化含量鉴定
 

　　作为表观遗传学研究中重要的一个研究方向——甲基化程度分析，现阶段有不同的方法或技术来进行研究：如传统的亚硫酸氢盐处理后的克隆测序统计法、抗体检测法、定量PCR检测法等。这些方法皆因方法学的问题而不能获得的定量，而微滴式数字PCR系统通过对样品的微滴化处理及目标因子的拷贝数定量，为甲基化程度的定量检测提供了一种全新的技术。
 

　　5. *的伴随诊断
 

　　常用体液来源(如血液，胸腹水，唾液及尿液等)的待检标本中的DNA，有正常脱落体细胞和病变脱落细胞两种来源，前者的量远大于后者。通过微液滴处理能在每个微液滴中有效减少正常体细胞DNA的干扰，实现肿瘤标记物的有效检测，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突变检测、乳腺癌/胃癌的HER2基因扩增检测等，应用于肿瘤医学的伴随诊断。
 

　　6. 无创*
 

　　无创伤的产前诊断, 如21号染色体为3倍体的唐氏综合征、已知父母基因型的胎儿地贫检测或已知父母基因型的其它核酸病检测(孟德尔相关遗传疾病)。目前标本来源主要为血液，而待检测的胎儿DNA受到母体DNA的干扰，影响了检测的准确性。而QX200检测系统*的微滴化技术*可以作为二代测序法的补充来进行的无创伤产前诊断，从而提高工作效率及节约成本。
 

　　7. 病原微生物的检测(病毒、细菌等)
 

　　疾病预防控制中心、出入境检验检疫局系统的实验室目前主要采用基于TaqMan探针法的定量PCR体系对病原微生物进行核酸水平的检测，而这些目前正在使用着的检测体系可以无缝地转移到QX200上，从而满足该类实验室对于检测结果的要求：灵敏度更高、重复性更好、无需依赖标准曲线的定量结果，同时操作简便。
 

　　对于其他类型的研究实验室，也可以利用ddPCR灵敏度高的特点，对各种样品中的病原微生物展开广泛的研究。如HIV抗逆转录病毒治疗过程中病毒残留量的监控;HBV耐药突变的检测;HCV的分子分型;抗**的院内感染监控;环境微生物不同功能基因之间的连锁分析等等。
 

　　8. 转基因食品或成分的检测
 

　　目前在确定转基因作物或成分的含量时采取定量PCR的标准曲线法，这种方法需要依赖于已知浓度的标准品(Certified Reference Materials Calibrants, CRMCs)。ddPCR定量的方式可以*解决这些标准物质的定标工作。
 

　　9. 二代测序辅助建库
 

　　目前靶向测序建库方法包括扩增子方法，在均相溶液中，当扩增引物增加时，由于扩增引物之间的相互作用，从而影响扩增的效率;如果将其分散到大量微液滴中扩增，将可大大降低引物间相互作用，提高扩增效率。同时还可以实现对于少量模板的有效扩增，得到更多的有效测序数据。
 

　　10. CRISPR-Cas9基因编辑结果验证
 

　　CRISPR-Cas9技术的发明，是基因编辑技术的一大突破，但如何验证实验是否成功，仍需要高灵敏度的检测方法，数字PCR技术可以满足这一需求。Broad研究所张锋团队发明了以CRISPR为基础的SHERLOCK技术可以对核酸进行高灵敏度的定性检测，但定量评估时仍采取了数字PCR进行确认。
 

　　11. *的实时监控
 

　　已有数篇文章报道了使用数字PCR技术对患者治疗过程中的循环肿瘤DNA(ctDNA)进行检测，实时监控疾病进展。在非小细胞肺癌、乳腺癌和肠癌等多种肿瘤患者中都取得了令人鼓舞的结果。与影像学及其他常规指标相比，ctDNA突变及丰度改变通常会提前数月出现，这样就可以提醒医生及时调整治疗方案，使患者得到更有效的治疗。
 

　　随着数字PCR荧光通道的增加和多指标检测的成熟，数字PCR将会进入更多应用领域，有力推动生命科学、医学诊断、检验检疫、农业等领域的快速发展。