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　　智立中特(武汉)生物科技有限公司主要致力于质粒微生物资源的保护、共享和持续利用，围绕我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展等重大需求，探索、发现、收集国内外的微生物资源，妥善长期保存管理;在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供质粒载体物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。旗下质粒载体网是一款提供质粒载体展示及定制的专业型网站，由智立中特(武汉)生物科技有限公司联合多家企业公司科研院校共同打造!主要展示了各种基因类型下的质粒载体!

　　1. Freestyle™ 293-F细胞的培养：在37℃，125rpm，8% CO2的摇床培养箱中培养;转染当天Freestyle™ 293-F细胞密度达到1.5-2.5×106个/ml时可以进行转染，但细胞存活率需>95%;可以使用生产的台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(C0011)进行细胞存活率检测。

　　2. 以50ml悬浮培养的Freestyle™ 293-F细胞为例，取两个洁净无菌离心管，分别加入1.25ml不含抗生素和血清的Freestyle™ 293-F细胞培养液;然后其中一管加入50μg质粒DNA，另一管加入100μl Lipo293F™转染试剂，分别用移液器轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。将含有DNA的培养液用枪轻轻加入含Lipo293F™转染试剂的培养液中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置15分钟(室温存放6小时内稳定)。

　　3. 把2.5ml Lipo293F™转染试剂-DNA混合物全部加入到50ml悬浮培养的Freestyle™ 293-F细胞中。由于青mei素/链mei素双抗可能影响重组蛋白的表达，通常不建议在细胞转染时加入双抗;如细胞培养环境容易发生污染，可酌情加入1/5常规用量的双抗。

　　4. Freestyle™ 293-F细胞在37℃，125rpm，8% CO2的摇床培养箱中继续培养48-72小时后，即可收集细胞进行目的蛋白的检测和纯化。

　　常见问题：

　　1. 转染效率低：

　　a. 优化质粒与Lipo293F™转染试剂比例，有必要是可以适当尝试加大质粒用量。

　　b. 应使用高纯度、无菌、无污染物的质粒进行转染，DNA纯度方面A260/A280比值要接近1.8通常宜控制在1.8-1.9范围内，偏低则有可能有蛋白污染，偏高则有可能有RNA污染。可以使用生产的质粒大量抽提试剂盒(D0026)进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。

　　c. 需用无抗生素和无血清培养液配制Lipo293F™转染试剂和质粒的混合物。

　　d. 转染后培养时间不足，而被误认为转染效率偏低。悬浮状态下的Freestyle™ 293-F细胞转染后至显著表达所需培养时间通常为48-72小时。

　　e. 检查细胞是否有支原体感染，支原体感染会影响细胞增殖，并很可能影响转染效率。

　　f. 如果没有检测到目的蛋白表达，应该仔细核对转染质粒的测序结果，确保测序结果和读码框wan全正确。

　　g. 检查转染时细胞密度是否过高。

　　2. 细胞毒性较明显：

　　a. 目的基因的表达蛋白有毒性。此时可以和空载体转染效果比较，以确定是否是目的基因蛋白表达对细胞产生毒性。如果确定有细胞毒性，可以考虑适当减少质粒用量，并按照比例减少Lipo293F™转染试剂。

　　b. 检查转染时细胞密度是否太低。

　　c. 检查细胞是否有支原体等微生物污染。