大鼠瘦素（LEP）ELISA试剂盒使用说明书 

 本试剂盒仅供体外研究使用!

 北京冬歌生物科技有限公司   ：

 预期应用  ELISA法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中瘦素（LEP）含量。

 实验原理  用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗LEP抗体的微孔中依次加入标本或标准品、*化的抗LEP抗体、HRP标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的LEP呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。      试剂盒组成及试剂配制   1.        酶联板：一块（96孔）   2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好 后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为20 ng/ml，做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释）后，分别稀释成20ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。如配制10 ng/ml标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ） 20 ng/ml的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。  3.  样品稀释液：1×20ml。 4.检测稀释液A：1×10ml。 5. 检测稀释液B：1×10ml。  6.检测溶液A：1×120μl（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀 释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。  7.溶液B：1×120μl/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。 稀释方法同检测溶液A。 8.底物溶液：1×10ml/瓶。  9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。  10.终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 11.    覆膜：5张  12.使用说明书：1份    自备物品   1.   酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）  2.微量加液器及吸头，EP管 3.   蒸馏水或去离子水，全新滤纸     标本的采集及保存  1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。  2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。  3.  细胞培养物上清或其它生物标本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可 检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。  注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1个月，-80℃不应超过2个月；标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。    操作步骤  实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。 1.        加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。  2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜, 37℃反应60分钟。  3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟， 大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。   4. 每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液） 100μl，酶标板加上覆膜 37℃反应60分钟。 5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟， 350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。  6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内， 此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。  8.        用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止 液后立即进行检测。    注：  1.  试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。  实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。  2.   加样：加样或加试剂时，请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，*个孔与zui 后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间（包括标准品及所有样品）控制在10分钟内，如标本数量多，*使用多道移液器加样。  3.   孵育：为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。 4.   洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直 接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响zui后的酶标仪读数。 5.  试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理， 以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请配置标准品及工作液，尽量不要微量配置（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10μl），以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。 6.  反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔 10分钟），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。  7.  底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。     建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。      如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。    洗板方法 1.  手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将*的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。  2.  自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。    特异性      本试剂盒可同时检测重组或天然的大鼠LEP，且与其它相关蛋白无交叉反应。

   计算    以标准物的浓度为纵坐标（对数坐标），OD值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线。*使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。     检测范围：0.312 ng/ml - 20 ng/ml    zui低检测限：0.078 ng/mL    说明  1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染， 试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。  2. 试剂盒保存：短期（1周以内）以标签上的标示为准，*保存请将试剂全部保存于-20℃。 3. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。   4. 刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。  5.所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。 6. 有效期：6个月。