淀粉蛋白脑室内注射建立阿尔茨海默病大鼠模型
时间：2014-11-15 阅读：784
淀粉蛋白脑室内注射建立阿尔茨海默病大鼠模型
【摘要】 目的 观察β淀粉样蛋白（Aβ） 脑室内注射建立阿尔茨海默病（AD） 大鼠模型及其对大鼠行为、*乙酰转移酶（ChAT）活性、细胞凋亡、神经生长因子（NGF） 水平等影响。方法 将Aβ1242 注射入大鼠侧脑室,于第1 周、2 周、4 周观察Morris 水迷宫逃避潜伏期、测定脑内ChAT 活性、进行原位末端标记凋亡染色及NGF 免疫组化染色。结果 Aβ1242 注射后第2 周大鼠Morris 水迷宫逃避潜伏期延长,4 周时更明显。2 周后海马、皮层ChAT 活性下降,4 周后脑内ChAT 活性广泛下降,以海马zui为显著。2 周后基底前脑Meynert核区凋亡细胞较其他脑区增多,NGF 阳性细胞明显减少。结论 Aβ脑室内注射可以模拟AD 行为改变,使脑内ChAT 活性降低,基底前脑NGF 含量减少,*能神经元凋亡,可以作为AD 研究模型。
【关键词】 阿尔茨海默病 β淀粉样蛋白 *乙酰转移酶 神经生长因子
【中图分类号】 R749. 1 【文献标识码】 A
阿尔茨海默病（Alzheimer Disease , AD） 发病的中心环节是β淀粉样蛋白（β2amyloid protein ,Aβ） 在脑中的沉积[1 ] ,多种神经元尤其是*能神经元原发性变性,脑内*乙酰转移酶（cholineacetyl transferase ,ChAT） 活性下降,是AD 的标志性生化改变[2 ] 。AD 等神经系统变性疾病与细胞凋亡的发生密切相关[3 ] ,而神经生长因子（nerve growth factor ,NGF） 是中枢*能系统重要的神经营养因子,具有明显的抗凋亡作用[4 ] 。
AD 基础研究和药物开发的zui大障碍是缺乏一种与AD 病理、生化、和行为等改变相似的理想动物模型。本实验通过Aβ脑室内注射建立AD 大鼠模型,观察大鼠行为学改变、脑内各部位ChAT 活性变化、神经元凋亡情况,以及NGF 水平改变,为进一步的AD 治疗研究提供动物模型。
1 材料与方法
111 动物分组及Aβ脑室内注射 雄性Wistar 大鼠48 只,体重260～300 g ,随机分为4 组:对照组、Αβ注射后7 天组、14 天组、28 天组,每组12 只。大鼠麻醉后用微量注射器缓慢将药物注入右侧脑室（前囱后018 mm ,中线旁开111 mm ,深度316 mm） 。Aβ模型组注射Aβ1242 （购自美国AnaSpec 公司） ,每次7 μg ,连续3天,对照组注射生理盐水,每次7μL ,连续3 天。
112 Morris 水迷宫试验 参照文献方法[5 ] ,记录大鼠找到平台所需逃避潜伏期。各实验组分别于zui后1 次药物注射后第5～7d ,12～14 d ,26～28 d 进行试验,对照组同时试验。
113 取材 Aβ注射组分别于zui后1 次药物注射后第7 天、14天、28 天宰杀取材,对照组于zui后1 次药物注射后28 天取材。每组取6 只快速断头取脑,立即冻于液氮中,待测ChAT 活性。另6 只4 %多聚甲醛透心灌注后于4 %多聚*中固定72小时以上,进行TUNEL 凋亡染色及NGF 免疫组化染色。
114 ChAT活性检测及定量分析 液氮中冻存脑组织分别取海马、基底节、额叶、顶叶皮层制备5 %（V/ W） 脑组织匀浆, 按照Fonnum[6 ]的放免方法,在70μL 总反应体积中,含试样液或空白对照液20μL ,1114 g/ L 乙酰辅酶A（Sigma 公司） 10μL ,70 mmol/L *（Sigma 公司） 8μL ,1 mmol/ L 溴化新斯的明（Sigma 公司） 7μL ,3 mmol/ L 氯化钠7μL ,317 ×104 Bq/ mL 14C2乙酰辅酶A 10μL ,在液体闪烁仪上测定每分钟衰变数（cpm） 。以对照组各部位衰变数为100 % ,计算各组各部位ChAT 相对活性。
115 TUNEL 凋亡染色及半定量分析 选取基底节、海马、额叶、顶叶同时存在矢状断面切片,按TUNEL 凋亡染色试剂盒（武汉博士德公司） 说明书操作,进行TUNEL 细胞凋亡染色。每只鼠脑染色2 张切片,每一切片高倍视野（400 ×） 下每部位取4 个视野共计数100 个神经元,计算凋亡神经元阳性百分率,即神经元凋亡指数（NAI） 。
116 NGF 免疫组化染色及图像分析 取上述石蜡切片,按NGF免疫组化试剂盒（武汉博士德公司） 说明书操作染色。每只鼠脑染色2 张切片,每一染色片高倍视野（400 ×） 下取5 个视野,用美国UIC 公司Metamorph Image System V416 图像分析软件得出阳性染色细胞平均灰度值（Average gray value Average） 。
117 统计学分析 计量资料用均数±标准差（ x ±s） 表示,各组间ChAT 活性、水迷宫试验潜伏期、NGF 阳性神经元平均灰度值比较采用t 检验,神经元凋亡指数组间比较采用χ2 检验。
2 结果
211 Morris 水迷宫试验结果 各组逃避潜伏期分别为:对照组（1211 ±514） s ;Aβ注射后7 天组为（1411 ±519） s ,Aβ注射后14天组为（2116 ±617） s ,Aβ注射后28 天组为（4510 ±1013） s。Aβ注射后7 天潜伏期与对照组比较无变化,注射后14 天潜伏期延长（ P < 0105） ,注射后28 天潜伏期明显延长（ P < 0101） ,提示大鼠学习记忆功能受损。
212 Aβ脑室注射对ChAT 活性影响 Aβ脑室内注射对脑内ChAT 活性影响见表1 。
表1 Aβ对ChAT活性（ cpm） 影响
组 别 额叶基底节海马顶叶
对 照 组1208. 5 ±49. 8 3662. 3 ±118. 5 2584. 0 ±98. 8 1184. 2 ±53. 2
Aβ注射后7 天1183. 8 ±26. 7 3559. 7 ±120. 3 2513. 0 ±99. 8 1139. 3 ±43. 6
Aβ注射后14 天1033. 4 ±47. 92）3507. 5 ±126. 6 2234. 2 ±84. 52） 1088. 3 ±63. 01）
AB 注射后28 天950. 1 ±67. 52）3228. 5 ±153.
02） 1833. 0 ±57. 62） 941. 8 ±42. 42）
1） 与对照组比较, P < 0. 05 2） 与对照组比较, P < 0. 01
脑室内注射Aβ7 天后,各部位脑组织ChAT 活性无明显下降,
14 天后海马、额叶ChAT 活性明显下降,28 天后各脑区ChAT 活性均明显下降（ P < 0101） ,以海马下降zui明显,降至对照组的71 %。
213 Aβ对脑内神经元凋亡的影响 TUNEL 凋亡染色可见细胞核呈棕黄色染色的阳性凋亡细胞,对照组及注射后7 天各脑区见个别散在凋亡细胞,Aβ注射后14 天可见少量凋亡细胞,28 天后明显增多,NAI 升高,基底前脑Meynert 核区达1917 % ,海马、额叶、顶叶分别为617 % ,512 % ,413 % ,Meynert 核区神经元凋亡明显多于海马及皮层（ P < 0101） 。Meynet 核凋亡染色见图1 。
214 Aβ对脑内NGF 表达水平的影响 NGF 免疫组化染色于海马、额叶、顶叶、基底前脑均可见胞质黄褐色深染阳性细胞,Aβ注射7 天后无明显变化,14～28 天可见基底前脑区NGF 阳性细胞明显减少,染色变浅,其他脑区NGF 表达水平无明显变化。基底前脑区NGF染色见图2 。用美国UIC 公司Metamorph Image System V416 图像分析软件得出阳性染色细胞平均灰度值（Average gray value） 。
表2 NGF 免疫组化染色细胞平均灰度值
组 别 额叶基底节海马顶叶
对 照 组135. 48 ±17. 27 129. 67 ±18. 49 126. 87 ±9. 56 138. 46 ±13. 54
Aβ注射7 天后129. 32 ±14. 47 134. 57 ±10. 38 125. 48 ±8. 21 139. 76 ±9. 72
Aβ注射后14 天131. 21 ±17. 82 149. 65 ±9. 431） 129. 24 ±12. 59 128. 45 ±12. 43
Aβ注射后28 天126. 34 ±15. 97
175. 54 ± 12.
942） 116. 75 ±11. 16 128. 27 ±10. 03
1） 与对照组比较, P < 0105 2） 与对照组比较, P < 0101
3 讨论
近十多年积累的资料表明,前脑基底核的*能神经元、海马和它们之间的通路,是学习记忆功能的重要结构基础,损毁这些结构或老龄化,可引起这些区域退化,导致智力严重缺损[7 ] 。ChAT 是ACh 的生物合成酶,存在于*能神经元中,是衡量*能神经元功能的标志,也是AD 动物模型成功的标志性生化指标[2 ,8 ] 。迄今为止,多数AD 物模型（如老年动物代替模型、*能系统损毁模型、转基因小鼠模型） 是在模仿AD 早期出现的记忆障碍或病理特征,使其应用受到局限。本实验采用大鼠急性脑室内注射Aβ1242 ,4 周内大鼠水迷宫试验表现逐渐下降,出现了AD 表现,与文献报道一致[9 ] 。脑内海马、基底节,以及额叶、顶叶新皮层ChAT 活性均明显下降,降至对照组水平70 %以下,说明Aβ脑室内注射对脑内ChAT 活性的影响是广泛和明显的。Aβ沉积是AD 发病的中心环节和病理特征,本模型全面模拟了AD 病理、行为学和生化改变,因此脑室内Aβ注射可以作为一种理想的AD 模型制作方法。ChAT 活性的下降实际上反映了*能神经元功能的下降或变性,近年来越来越多的证据表明,*能神经元退化的主要方式也是细胞凋亡[3 ] 。本实验发现ChAT 活性降低的同时,脑内基底节、海马等处的凋亡神经元增多,并且以*能神经元聚集的基底前脑区更为明显,所以ChAT 活性的降低可能源于Aβ所致的*能神经元凋亡。基底前脑*能神经元发出纤维投射到海马、边缘叶及大脑皮层,这些部位靶细胞中产生的NGF 通过*能神经元的轴突末梢摄取后,经轴浆逆向运至其胞体所在的神经节,是基底前脑、隔区*能神经元的主要营养因子。Aβ脑室内注射后2 周开始,基底前脑神经元NGF 含量减少,4 周时zui明显,推测在本模型中,由于NGF 对基底前脑中枢*能神经元营养、支持作用减弱,导致神经元发生凋亡,引起AD 的一系列行为学、生化改变。如果能采用基因治疗等方法及时补充基底前脑NGF ,将有可能治疗AD 症状,延缓AD 的进展,目前基因治疗AD 是国内外研究的热点,也是我们下一步的研究方向[10 ] 。综上所述,Aβ脑室内注射造成大鼠AD 样行为学改变,脑内ChAT 活性降低,基底前脑NGF 含量减少,*能神经元凋亡,可以作为AD 研究的动物模型。