利用MALDI-TOF进行快速可靠的微生物鉴定

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)指纹图谱法是一种微生物分类和鉴定的快速可靠的方法，可广泛应用于临床诊断、环境和分类研究或者食品加工质量控制中。BioTyperTM MALDI-TOF质谱仪指纹图谱法可使研究人员在几分钟内就可鉴定不明细菌、酵母菌和霉菌。

微生物表达谱分析的一般工作流程是一个直线性路径(图1)。从一个单克隆或其它生物材料开始，样品可以在几分钟内被分析。每个样本的自动谱图获取可以在几秒钟内完成，并且可以实现数据向专门鉴定软件的无缝传输。因此这项技术可以*的替代经典的微生物鉴定和分类技术，它仅需要极少的样品处理和费用。

MALDI-TOF测定

多数简单的样品分析从将少量生物材料直接放置到MALDI-TOF靶盘开始。初始材料可以是一个单克隆或者液体培养基离心的一个组分。微生物薄膜用基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸；HCCA)覆盖。

质谱谱图用MALDI-TOF质谱仪以线性正性模式用zui大频率(20-200Hz，依赖于仪器)获取。谱图的测量质量范围是2000-20000Da。谱图自动获取可以用Bruker’s ‘autoExecute’软件用激光强度的模糊控制来进行。

重复性

在很宽的条件范围内，该方法都被证明是很稳定的。生长培养基的不同组成对峰模式分布影响非常小；在从4000到12000Da的范围内，几乎没有观察到培养基的影响。附着在克隆上的培养基对峰模式没有影响。同样，细胞的生长状态对峰模式也没有影响。缓慢生*的细胞与对数生*、平台期或者死亡期的细胞具有相似的模式。

此外，在标准条件下进行样本制备和测量后，在不同的MALDI-TOF仪器上获取的质谱谱图具有很高的可比性。在3个不同的仪器上，对同一样本靶测量的谱图实际上是一致的。因此，来自于不同MALDI-TOF质谱仪的谱图可以用来建立真实可靠的数据库。

这种方法学惊人的重复性是建立在对稳定表达的高丰度的蛋白质测量基础上的，比如核糖体蛋白质。在很少出现代谢物的2000到20000Da质量范围内，波谱图也可被观察到。与活细胞相比，细菌芽孢可以产生明显不同的峰模式，而且这些“芽孢谱图”也具有重复性。

BioTyper软件

我们的BioTyper分析软件整合了鉴定与分类的处理质谱谱图的所有功能。这些处理参数是用户可以定义的，并且结果是一个专门的峰列表。

为了鉴定未知微生物，模式匹配是通过将产生的峰列表与含有大量种属特征的波谱库相比较来完成的。特征波谱库是通过对已知细菌种属和菌株在细微差别的条件下进行的若干次测量来产生的。然后提取特征峰信息，好的平均数通过测量20个谱图来获得。软件从整个谱集中自动生成峰列表并提取典型峰，这些峰出现在从一种属来源的一定数量的谱图中。

未知微生物通过它们各自的峰列表与数据库的比较来鉴定。依据确定的质量数和它们的强度的相关性生成一个匹配值，这个值用来对结果进行排序(图2)。为了提高数据库检索的准确性，BioTyper可通过*的再校准算法来校正峰质量数偏移。在峰提取之后，可以设定一个初始的可以接受的误差窗口并得到一个想要的调节结果。软件在可调节范围内可以进行新的峰列表对已知峰列表的校准。因此甚至质量数偏差5000ppm的谱图仍然可以被成功鉴定。这个功能使得BioTyper鉴定变得格外的可靠和准确。

为了减少重复，BioTyper提供了很多功能，如聚类和生成家庭树。依据相似性分值，可以建立树状图。而且，一项基于要素分析的不受监管的多变量分析成为可能。使用计算的要素成分，多种聚类算法和可视化法都可达到。

应用

BioTyper给很多领域(例如环境研究、食品和水源控制和医学诊断等)的传统微生物实验室鉴定提供了一个的方法，其样品制备和测量快速、稳定和低耗费的特点使它非常适合常规和高通量应用。

这个方法对种系分类分析也十分有用。MALDI-TOF质谱仪表达谱分析可产生和经典的16S核糖体DNA测序一样的家庭树，因为核糖体蛋白是高丰度且十分稳定，所以观察蛋白表达模式可以直接的考察DNA序列翻译的情况。因此，确定分子质量组成的方法和多基因位点测序一样有价值。

依据质谱表达谱模式来降低复杂微生物群落的重复性为科学研究提供新的能力(如在环境研究和生物多样性的调查方面)。成千上万的微生物可以通过BioTyper简单的进行分析，然后可以作为进一步分析的基础。初始的微生物参考谱图集可以用来进行相互比较，冗余的可以去除。进一步分类的微生物可以与初始的参考数据集进行比较，然后去除或者加入谱图库来创建微生物多态性的概貌。