目前使用二种激发照明方式，一为透射方法，另一为反射方法。透射激发是过去沿用下来的方法，往往只需在普通显微镜前方设置一个超高压汞灯作光源，灯前设置激发滤光片，在目镜处设置遏止滤光片，这样即可作一般透射荧光观察，比较经济实用，使用也很习惯。目前的透射荧光显微镜，其聚光镜用，暗场荧光照明固然有它的优点，但对使用也带来不便之处，主要是暗场聚光镜的高低位置调节及水平面上的调中都比较困难，此外，由于暗视野及微弱的荧光象使显微镜调焦成象也比较困难。
与透射荧光相比，采用反射激发荧光具有以下一些优点：

一、由于本身起着聚光镜作用，因此*省却了聚光镜调中及上下调节问题。物镜转换后，对透射显微镜来说，聚光镜仍需调中心。而反射则不需要。
二、对于透射激发时，大部分荧光产生于朝聚光镜一面的标本表面层，显微镜是通过标本厚度来观察荧光象的，因此，标本的荧光象由于透过标本厚度时被标本的吸收及散射等原因而减弱了，而在反射激发时，激发光照射的方向与观察方向是一致的，这种方法获得的荧光象的亮度可以比较高，并且成象质量也好，尤其对厚标本的观察更是优于透射荧光观察。
三、所采用的紫外光源功率比较低，这是在同样亮度荧光象情况下，反射激发荧光光源功率可以比较低，一般来说，透射荧光显微镜所采用的高压汞灯的功率要200 瓦，而落射荧光显微镜所用高压汞灯功率只要70 瓦，这就可以大大减小标本荧光的衰退速度，这对观察及显微摄影都极为有利，因此，在荧光显微镜中，提高显微镜收集荧光的能力比加强荧光光源强度更重要。
四、中高倍观察时，落射照明的荧光亮度比透射照明高得多，而低倍观察时，则相反，透射照明的荧光亮度比落射照明要高，这种情况是由于透射照明时采用一个聚光镜，适用于各种倍率物镜，而落射照明时，物镜也起聚光镜作用，也就是不同的物镜有不同的聚光镜，高倍时能充分利用紫外光。
五、在落射照明中，物镜既起聚光镜作用又起物镜作用，当它起聚光镜作用照亮标本时，由于标本的照明光强与聚光镜的NA 平方成正比，在此，也即与物镜的NA 平方成正比。在成象光路中，荧光象的亮度又与物镜的NA 平方成正比，因此，在落射荧光中，物镜NA 的提高对提高荧光象的亮度效果极大，从上面所分析的结论，荧光象的亮度实际上与物镜的NA 的四次方成正比，所以要研制中倍率的高NA 的物镜是很有意义的。此外，采用浸液物镜，可以避免标本与物镜间的反射损失，这对提高荧光象的亮度也是有利的。落射荧光装置中的二向性分光镜与主光轴成45°倾斜，它的功能是反射激发光线，而让标本所发出的荧光通过，由盖玻片所反射的激发光有遏止滤光片阻挡掉，这样，观察荧光象时背景是*黑暗的。
六、利用反射激发时，显微镜工作台下的透射照明装置可作混合照明用。例如，荧光与相衬联合使用，此外，利用台下的明场照明可作寻找目标用，这要比直接使用荧光（暗视野）寻找目标方便得多。当用明场定标后，再转换至荧光，对所需要观察的目标进行短波激发，然后进行观察或显微摄影。如果要摄影的话，应事先做好一切准备，以利于抓紧时机及时把所要记录的图象记录下来。