维生素D是一种脂溶性维生素，其具有促进生长和骨骼钙化，促进牙齿健全、用于治疗佝偻病、骨软化症等功能作用，是一种大家广为熟知的营养元素。《中国药典》2020年版《0722维生素D测定法》，保留原先的第1、二、三法外，新增加了第四法——柱切换二维液相法。
 

　　本次，小编和您一起探讨新加入的第四法。
 

　　什么是柱切换二维液相法？
 

　　柱切换二维液相法是将不同选择性分离柱组合，加强分离能力的联用技术。柱切换液相色谱系统通常由第1维分离柱和第二维分离柱串联组成，两柱之间以切换阀作为接口，通过流动相流路的改变，将部分或全部第1维柱流出的组分，导入第二维柱进行二次分离，从而起到净化目标化合物，提高系统分离能力的作用。如果只是将部分组分导入第二维柱分析，通常又称为中心切割二维液相法，用LC+LC表示；如果是全部组分全部导入第二维柱，通常称为全二维液相色谱法，用LC×LC表示。
 

　　新增加的第四法，优点有哪些？
 

　　《中国药典》2020年版四部《0722维生素D测定法》，采用高效液相色谱法测定维生素D制剂中所含维生素D含量，以及维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D(折算成维生素D)的总量。
 

　　•当待测药品中无维生素A及其他杂质干扰可用第1法测定，否则应按第二法处理后测定；
 

　　•如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三法测定，或不经前处理按第四法测定。第二法和第三法的供试液制备需要采用“正相收集、反相洗脱”，第三法为了进一步去除前维生素D峰的杂质干扰，还增加了水浴加热再净化的过程，前处理较为麻烦，一个实验常常需要2~3天时间来完成；
 

　　•第四法通过在线净化的方式，省去了复杂的前处理步骤，让仪器来代替复杂的人工操作！且相比较而言，第四法的仪器配置更为简单，是药品中维生素D检测的不错选择！
 

　　岛津应对方案
 

　　该方案在岛津中心切割二维液相系统上进行。系统配置包括一维二元高压系统和二维四元低压系统，两个紫外检测器，一个进样单元和一个柱温箱；柱温箱中装载两根不同性能的色谱柱，并通过加载一个高压流路切换阀实现一维和二维的实时切换。
 

图1. 岛津二维液相(中心切割)系统
 

　　01前处理：
 

　　按照《中国药典》2020年版四部通则0722维生素D测定法第四法要求进行制备。
 

　　02分析条件：
 

　　第1维色谱柱：HILIC-10(2.1x150 mm，3 µm)
 

　　第二维色谱柱：RX-SIL(3.0x100 mm，1.8 µm)
 

　　第1维流动相：A相：正己烷；
 

　　B相：正己烷-正戊烷-异丙醇(98：1：1)；
 

　　按下表程序进行梯度洗脱
 

第二维流动相：正己烷-正戊醇-异丙醇(996：2：2)，等度洗脱
 

　　流速：0.5 mL/min
 

　　进样体积：100 µL
 

　　柱温：40℃
 

　　检测波长：265 nm
 

　　收集管：聚醚醚酮(peek)管，内径0.0762 cm(0.03英寸)，20 m，容积约9 mL
 

　　03对照品溶液色谱图：
 

　　取方法中的校正因子f2上机测试，得到对照品溶液色谱图。其中第1维液相维生素D的理论塔板数超过2500，与前维生素D的分离度>5；各峰的重复性为0.76%~1.46%(n=5)，均满足药典的要求。
 

图2. 对照品溶液第1维色谱图(上)和第二维色谱图(下)
 

　　04供试品溶液色谱图：
 

　　取制备好的供试品溶液上机分析。在第1维色谱图中，由于维生素A醇和油脂的干扰，前维生素D被大量杂质峰包裹，无法检测；将该时间段的物质切入第二维色谱中继续分析，前维生素D和维A醇、油脂等杂质在第二维色谱图中得到了有效的分离。
 

图3. 供试品溶液第1维色谱图(上)和第二维色谱图(下)
 

　　05参与验标工作：
 

　　岛津广州分析中心参与了该方法的验标工作；制标专家和岛津工程师共同建立并验证了方法，方法可靠、稳定，可有效地应对《中国药典》0722通则第四法柱切换色谱法。