Modular Spectroscopy Tools for Measuring Intrinsic Protein Fluorescence

　　模块化光谱仪在测量蛋白质本征荧光中的应用

　　本征荧光是一个强有力的蛋白结构和功能的测量的指示物质。荧光的强弱可以让研究者洞悉在不同生物学条件下的构象状态与活动。对于荧光的测量，稳定可靠的激发源和发光二极管(LEDs)是个实惠的选择。海洋光学的LLS-280 280 nm UV LED用于QE65 Pro板载线阵CCD 光谱仪，在不同构象机制情况下从*和牛血清白蛋白中测量本征荧光。对于简单的试管抽样，使用多变四用CUV-ALL-UV比色皿比色槽镜面光纤管固定器。结果表明模块化光谱测量与蛋白中的荧光监测结果相当，但是其他需要紫外激发的生物分子和非生物样本可以使用类似的系统测量。

　　仪器简介

　　See the Fluorescence Setup

　　See the Absorbance Setup

　　背景

　　大多数蛋白质含芳香氨基酸，荧光蛋白可被紫外感知。样本荧光光谱测量来源于氨基酸组成和蛋白质的构象状态。当蛋白质从原始状态（折叠）到变异状态（展开），在芳香氨基酸周围的环境也变化了，影响了氨基酸的荧光性质。这些本征蛋白的荧光变化可通过荧光反应监测蛋白质展开。

　　蛋白质的自然状态可以通过许多不同方法改变，包括升高温度，离液序列高的或其他化学药剂比如尿素或盐酸胍，还有调整pH值。随着蛋白质的变形，先前在蛋白疏水核中的氨基酸外露出来。溶剂中的暴露以及由此导致对荧光猝灭剂更加敏感，使得*（Trp），络氨酸（Tyr）和苯基*（Phe）的荧光减弱。含Trp和Tyr（各自280 nm and 274 nm激发）的蛋白，zui适宜采用紫外激发荧光进行蛋白表征，因为他们有相对较高的量子产率和相似的激发波长。Phe的量子产率较低，必须使用更短的波长(~257 nm激发)激发，所以通常不用于蛋白质确证。

　　随着紫外LED性能的提高与成本的进一步降低使得其相较传统LED灯更具竞争力。紫外LED输出能量增加为已有的LED优势又新添一笔，其中包括低能耗，长寿命和低价格。随着可选择波长的增多，应用范围和紫外LED的用途也增加了。其他非生物应用包括在UV-C领域（280nm以下）用LED进行消毒和净化，在UV-B领域（280-315nm）用LED农业照明，以及在UV-A领域（315-400nm）使用LED进行防伪鉴别和材料的紫外固化。

　　紫外LED还适用于生物分子和其他紫外荧光测量紫外激发。紫外LED激发相比宽谱光源，无需滤光片滤除与发射光谱重叠的激发源，而宽谱光源由于添加滤光片会同时减弱发射光谱的强度，影响系统的灵敏度。

　　LLS-280 紫外LED与QE65 Pro 光谱仪搭配使用，从*和牛血清白蛋白（BSA）样本中测量蛋白荧光。荧光样品为稀释在磷酸盐缓冲盐水(1X PBS pH 7.4)和0.1 M HCl/KCl (pH 1)中的蛋白质，本征荧光光谱用于蛋白质确证。

　　探测条件

　　将3 mg/mL Lysozyme (L6876 Sigma) 和12 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA – A2153 Sigma)样品溶解于1X PBS 和0.1 M HCl/KCl中。PBS是用于保持样本pH值一致性的常用缓冲溶剂。悬浮在1X PBS的蛋白质应当保持它的原始（折叠）状态。当蛋白悬浮在较低pH值的溶液中时，由于蛋白质在溶剂中开始变性并将氨基酸现在包含在蛋白核中。将5 mg/mL L-Tryptophan (T90204 Aldrich)的溶液准备在去离子水中，测量吸光度，确定Trp的*激发波长，为Trp荧光提供参考。

　　荧光测量使用QE65 Pro光谱仪 (光栅 HC-1, SLIT-200), LLS-280 UV LED光源，一对QP600-2-SR 耐晒600 um光纤盒CUV-ALL-UV 四用比色皿。CUV-ALL-UV配置90度荧光反应并光纤盒比色皿和耦合比色皿，相对于另一个和74-msp镜像螺丝插头双口比色皿来说，提高了荧光测量的灵敏度。荧光测量使用CVFL-Q-10 10 mm路径长石英比色皿，10秒积分时间，平均1个校验和5个平滑值。比色皿和黑布用来在10秒测量中隔绝环境光线。

　　QE65 Pro用户多变的狭缝特性使得L-Trytophan样本吸光度测量使用相同的QE65 Pro单元用于荧光测量。为吸光度测量狭缝变至10微米，使用QE65Pro光谱仪，DH-2000-BAL 平衡氘卤钨灯光源，一对QP300-2-SR 300 um 耐晒光纤和CUV-ALL-UV四用比色皿，为吸光度配置准直透镜面对面。吸光度测量使用CVFL-Q-10 10mm路径长的石英比色皿，79毫秒集成时间，50次校验和3次平滑。

　　实验结果

　　水溶液中Trp吸光度和荧光光谱如图1所示。Trp是内在蛋白荧光谱中的主要部分之一，有芳香族氨基酸的高量子产率。Trp吸光度光谱显示左边的峰红色的在~280 nm是从Trp吲哚环基的。荧光光谱在LLS-280nm LED的右边蓝色部分峰在~350nm.280nm的波长选自Trp波长zui强吸收率。在274nm附近zui有激发态Tyr，显示了与Trp相似的吸收光谱。根据这些吸光度特性，LLS-280 UV LED可用于在蛋白非折叠测量中激发Tyr和Trp的荧光。

　　BSA稀释到1X PBS and 0.1 M HCl/KCl荧光光谱如图2所示。BSA是血浆运转中作为载体蛋白和合适体液分布渗透压运转的主要部分。当BSA溶解在低pH值的0.1 M HCl/KCl溶液中，蛋白确证改变，在不同环境下暴露Trp和Tyr氨基酸。荧光光谱在亮度上减少，在蛋白从折叠1X PBS (red fluorescence curve)变为非折叠状态时 (蓝色荧光曲线)，荧光峰转换成更短的波长。

　　溶解酵素溶解于1X PBS and 0.1 M HCl/KCl，内部蛋白荧光光谱如图3所示。溶解酵素是一种酶，以细菌的细胞壁分解成细胞溶菌命名。溶解酵素用于从鸡肉蛋白中分离成抗微生物剂的测量。当溶解酵素暴露于低pH值的溶液中时，蛋白确证改变，在不同环境下暴露Trp和Tyr氨基酸。当蛋白从1X PBS (红色荧光曲线)变为非折叠状态（蓝色荧光曲线），荧光光谱在亮度上减少。如BSA一样转移排放；然而，在溶解酵素的例子中，第二个峰到蓝色主峰表示了在酸性环境下蛋白结构状态的变化。

　　BSA和溶解酵素光谱变化的不同与芳香氨基酸成分的差异、蛋白质的确证和蛋白变性状态的光物理相关。BSA比溶解酵素具更高的Tyr容量，但是溶解酵素比BSA含更高的Trp。此外，氨基酸组成的不同，倾向于氨基酸残基不暴露在酸性条件中相同环境下。部分展开的蛋白环境与全变性蛋白环境不同。蛋白聚合后，在特定的环境条件下，也可能再变性。

　　实验结论

　　BSA和溶解酵素的结果仅仅是这些蛋白确证的开始。使用文中标书的工具，更容易获得更完整的蛋白质折叠图像。离散剂如胍或DMSO，可用于增加蛋白质浓度，提供颗粒度更高的蛋白确证信息。蛋白还可以通过温度调节小型比色皿如qpod (e.g., CUV-QPOD-FLKIT)，慢速增加样本温度逐渐折叠。还有，以通过用LLS-290 UV LED刺激295nm的*荧光（支配其他芳香族氨基酸），Trp荧光还可从Tyr荧光中隔离。高功率可互换LED激励光源的使用覆盖了240-627nm的波长范围，为研究内部蛋白荧光和其他紫外激发荧光提供了更多机遇。紫外LED简化了荧光设置，提供了高功率激发能量，不需要背景激发能量的过滤。反过来这又要求了在更高浓度的更高质量的测量。LED波长的范围广，可以测试多个激发波长，研究者可用*波长来研究荧光激励的特殊荧光团。当紫外LED结合用户可选光谱仪如QE65 Pro和可换狭缝和灵敏的CUV-ALL-UV四用比色皿，覆盖紫外可见吸收波长范围使得大量的吸光度和荧光测量变得可行。

　　参考文献

　　The experimental protocol used for these measurements is described at http://www.physics.nus.edu.sg/~Biophysics/pc3267/Fluorescence%20Spectroscopy2007.pdf

　　相关应用注释

　　Conformational Analysis of Lysozyme Using Intrinsic Tryptophan Fluorescence

　　Ocean Optics High-sensitivity Spectrometer Assists Signal Transduction Research at the Netherlands Cancer Institute

　　Flexible Fluorescence Technical Tip

　　相关视频

　　QE65 Pro Product Spotlight

　　QE65 Pro at PITTCON

　　Mineral Fluorescence