糖基化分析的重要性

单抗药物是近年来发展快的药物品种，在整个药物市场产值中已经占有超过12%的份额，超过1200亿美元。目前，已经批准的单克隆抗体药物超过了80个，年销售额增长率超过30%，主要应用于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病等治疗领域。国内各大医药企业也聚焦于单抗药物的研发。

单克隆抗体结构主要由Fab和Fc两大功能区组成，在Fab段和Fc段特定的位点存在糖基化修饰。这些糖基化修饰发挥着极其重要的作用：能够维持抗体的空间构象、稳定抗体的结构，提高药物的热稳定性；糖链结构还能保护抗体不受某些蛋白酶水解，延长半衰期，提高药效；Fc段的糖基化修饰还会对抗体的安全性造成影响。因此抗体的糖型检测在产品质量控制中就非常重要。

目前的分析方法

糖链常用的分析方法有：液相色谱法、毛细管电泳法和阴离子交换色谱法。但无论是液相色谱法还是毛细管电泳法，都必须使用试剂进行荧光衍生。此衍生耗时长（4小时）且会导致唾液酸丢失，不能准确分析含唾液酸样品。且也无法分析磷酸化糖及硫酸化糖。而离子色谱无需衍生，定量准确，可以覆盖分析所有糖类型。

离子色谱-糖分析方法

阴离子交换色谱-脉冲安培检测法，是目前的糖分析方法，具有无需衍生、分离度好、灵敏度高、同时适用所有糖修饰形态等诸多优势。

对于单抗药物的复杂糖基化，离子色谱可以从三个方面给予解析：

1.糖链水平的分析——N糖图谱测定

Ｎ—糖基化修饰的糖链可以通过肽糖苷酶Ｆ或肽糖苷酶Ａ酶切作用，或者肼解作用从糖蛋白上释放出来。糖链经净化后可直接进样，无需衍生，避免了衍生化过程中唾液酸化聚糖的结构改变。

Ofatumamab的N糖图谱

离子色谱还可以和高分辨质谱联用，实现对色谱峰的鉴别。以Q Exactive为代表的Orbitrap超高分辨率质谱对未标记的糖具有高灵敏度，可解析糖链结构。安培检测器、高分辨质谱和离子色谱联用，可同时解决糖链的定性和定量分析。

2.单糖组成测定

单抗糖链主要由葡萄糖胺、半乳糖胺、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等单糖组成。单糖组成测定可以从基础水平上对单抗的糖组成差异给出解析。

对于中性糖和氨基糖的分析，通常使用酸水解的方式，使蛋白中的单糖释放。样品水解后，直接进样，无需衍生。

3.唾液酸的测定

唾液酸存在于单抗的糖链末端，对于单抗在生物体内功能的发挥起着相当重要的作用，影响药物的有效性。唾液酸的差异，是人源抗体和其他生物抗体差异的一个指标。唾液酸的释放，可使用温和酸水解或酶解。使用离子色谱分析游离的唾液酸样品，可直接进样，无需衍生。不同结构的唾液酸在CarboPac PA10色谱柱上可以得到快速的分离。

综上所述，离子色谱（IC）可用于单抗药物的聚糖图谱分析、单糖组成分析、唾液酸测定等方面。糖型检出覆盖率更高，适用于复杂唾液酸修饰糖型，极大的完善和推动了糖蛋白类药物N-糖链的质控分析。

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