大豆制品中尿素酶活性的测定方法
时间:2014-11-01 阅读:4020
方法一:酸度计法
1. 原理:根据AOCS法,测定出自于大豆及加工产品的尿素酶活化度。
2. 仪器
(1) 可调节温度的恒温水浴锅
(2) pH计
(3) 50ml碘瓶
3. 试剂
(1) 磷酸二氢钾
(2) *
(3) 尿素[CO(NH2)2]
(4) 甲苯
(5) 0.05M磷酸缓冲液:
磷酸二氢钾3.403g 100ml水中
混合1000ml,调pH为7.0
*4.335g 100ml水中
(6) 尿素缓冲液:取分析纯尿素15g,溶于500ml磷酸缓冲液,再加5ml甲苯防腐剂(防止霉菌发酵),调pH 值为7.0
4. 步骤
0.8g样品+40ml尿素缓冲液
试样粉碎到0.35mm以下 摇匀后放入 0.8g样品+40ml磷酸缓冲液
30℃ 恒温水浴槽中,每5min摇匀一次,反应30min,在5min内测定pH值。
5. 计算:尿素酶活化度(pH值上升值)=试样的pH测定值-空白的pH值
方法二 尿素酶快速测定法——酚红法(参考法)
称取0.2g经磨细的豆粕样品放置试管中,注入2%尿素1ml,开始计时,加入指示剂*2滴,再加入8ml蒸馏水,(20-30s)开始震摇试管约10s,直至全脂豆粕浮在液体层,每摇动10s约等待3s,再观察溶液层颜色,如果出现粉红色,计下时间,与尿素酶活性表对照,如果颜色不变,则再摇10s约等待3s,然后再观察溶液层颜色,重复操作,如一直不变,再重头开始。(做实验以前,要先做空白实验,如果呈粉红色则指示剂已经不能用,重新配置指示剂。震摇停止后观察溶液的颜色时要等3s,不可太快或太慢,否则会看错,晚间不能做该实验。
时间(min) | 豆粕尿素酶活性 |
0-1 | 0.9以上 |
1-2 | 0.9-0.7 |
2-3 | 0.7-0.5 |
3-3.5 | 0.5-0.4 |
3.5-4 | 0.4-0.3 |
4-4.5 | 0.3-0.25 |
4.5-5 | 0.25-0.2 |
5-6 | 0.2-0.15 |
6-7 | 0.15-0.1 |
7-9 | 0.1-0.05 |
12无色 | 0 |
方法三:尿素酶活性快速测定法——酚红法(粗略法)
1. 原理:尿素酶 + 尿素 氨气(用酚红作指示剂)
2.试剂
(1) N氢氧化钠:称0.4g氢氧化钠溶于100ml水中。
(2) 0.1N硫酸:将2.77ml浓硫酸加入1000ml水中稀释。
(3) 尿素—酚红溶液:
0.14g酚红溶于35ml水中+7ml0.1N氢氧化钠
混合 0.1N硫酸滴定 琥珀色
21g尿素溶于300ml水中
方法:将一匙粉碎过的黄豆粕放入小玻皿中,将已调好的尿素——酚红溶液加入小玻皿中的豆粕上,直至*锦湿,停留5min,观察豆粕的红色反应。
少量红点 | 微量活跃(△pH=0.05-0.10) |
约25%红点 | 中度活跃(△pH=0.10-0.25) |
约50%红点 | 活跃(△pH=0.30-0.50) |
约75%红点 | 非常活跃(△pH≧2.0) |
5min没红点出现,停留25min任无 | 豆粕过熟 |