在制药过程中，细菌内毒素的检测依赖于鲎血资源。随着注射剂、疫苗类、化学药品类等制剂品的需求不断增长，鲎血资源的使用率越来越高；同时，鲎试剂中含有B因子、C因子、G因子、凝固酶原，存在由1,3-β-D-葡聚糖激活G因子导致的假阳性结果。所以，建立一套不依赖鲎生物进行细菌内毒素检测的快捷、高效的补充替代方法尤为重要。

作为新型的重组鲎试剂检测方法：PSNG、rFC则备受关注。

一、PSNG和rFC的概念

01 PSNG

PSNG（基因重组鲎试剂）是一种基因工程技术合成的细菌内毒素定量检测试剂，该试剂不依赖鲎血资源，满足可持续发展的目标。

它完-全模拟了天然鲎试剂LAL的酶联反应，包含C因子、B因子、凝固酶原，是唯-一一种拥有与传统鲎试剂相同酶联反应,同时又消除了与1,3-β-D-葡聚糖交叉反应造成假阳性结果的内毒素检测试剂。

PSNG（上图右侧）成功去除了天然鲎试剂（上图左侧）的G因子干扰。

02 rFC

重组C因子法（rFC）是通过体外重组鲎凝血级联反应的第一个组分：C因子，激活的C因子直接剪切一个荧光底物，产生的信号被荧光酶标仪识别。相较于传统的动态LAL法，重组C因子法只有一种反应机制。

反应机制：左侧为基因重组鲎试剂 右侧为重组C因子试剂

二、LAL、PSNG、rFC对比情况

作为新型的重组鲎试剂PSNG、rFC，与传统的鲎试剂LAL进行细菌内毒素检测时又会有什么不同呢？

01 PSNG与LAL在检测内毒素上比较

（图1）

由图1所示，通过研究在显色底物存在下，使用三种重组酶原的多种组合，确定三种重组酶原是否能重建反应步骤。

结果证实，当三种重组酶原同时存在时，内毒素才能激活蛋白酶活性，得出了PSNG与LAL在检测内毒素上具有等效性。另外，研究证实了，三种重组酶原的蛋白酶活性大大增强，信号放大。

02 LAL、PSNG、rFC对内毒素敏感度比较

（图2）

从反应机制上看，rFC缺少了级联放大的两个环节（加速反应），只能通过荧光检测人为放大（减少了来源于自然反应的特异性）。

如图2所示，凝-血-酶的活化是LAL信号放大的主要驱动力；B因子的活化是针对内毒素的特异性活化，由此可以得出，PSNG（rCR）敏感度比rFC更高。

03 PSNG与LAL检测时间比较

（图3）

如图3所示，通过对一系列浓度RSE（细菌内毒素参考标准品）应用PyroSmart NextGen™（PSNG）和典型动态显色试剂检测得到的起始时间值，得出PyroSmart NextGen™较典型的动态显色试剂检测缩短了大约一半的时间。

04 PSNG与LAL批间一致性比较

（图4）

天然来源的LAL试剂具有固定的批次间变异性，而PyroSmart NextGen™试剂表现出批次间的一致性。图4所示，六个单独批次的PyroSmart NextGen™试剂的曲线标准趋于一致，证明PSNG具有重复性和可预测性的性能。

05 PSNG与LAL对内毒素特异性比较

（图5）

图5的X-Y轴分别表示的是加标/不加标1,3-β-D葡聚糖的各批次PyroSmart NextGen™和系列标准浓度的反应。结果显示了添加1,3-β-D葡聚糖对应用PyroSmart NextGen™对内毒素的检测不存在干扰，各批次间相关性良好。

06 PSNG验证性能

（图6）

（图7）

如图6、图7所示，应用PyroSmart NextGen™在50-0.005 EU/mL内毒素范围内，在两批次、四个分析人员、三天内条件下，执行了24个性能验证实验。依据ICH Q2指南标准，结果显示各验证参数满足标准要求。

07 PSNG、rFC、LAL针对检测样品的比较

（图8）

（图9）

（图10）

图8、图9、图10所示，适合性/一致性研究测试了多个成品、水、缓冲液等样品，得出PyroSmart NextGen™较 LAL具有相等或较低的不干扰稀释倍数(NID)。另外，Muroi 等人报告了使用PyroSmart NextGen™前身 PyroSmart 试剂检测药典118种肠外注射药物得出了相似的结果。

基于以上数据得出结论，重组鲎试剂方法(rCR)适合于广泛的产品检测。可比性研究测试了多种来源的细菌内毒素和水样，证实应用PyroSmart NextGen™检测具有较好的相对回收率。

08 PSNG、LAL、rFC方法对比

（图11）

如图11 所示，PSNG优于重组C因子法。PSNG检测过程不需要更换方法和设备，就能继续同样的工作流程。

三、总结

从LAL、PSNG、rFC对比情况来看，PyroSmart NextGen™较rFC、LAL在细菌内毒素检测上具有较强的优势：

相比重组C因子内毒素检测方法，PyroSmart NextGen™内毒素检测试剂可以产生级联放大反应，使得内毒素检测更加高效和灵敏。