叶绿素a的测定方法——乙醇+分光光度法

1、水样的保存水样注入水样瓶后，应放置在阴凉处，并避免阳光直射。若水样的进一步处理需要较长时间（大于12h），则应置于0℃~4℃低温下保存。水样量视水体中浮游植物多少而定，一般应采0.5~2L。

2、抽滤在抽滤装置的滤器中放入GF/C滤膜。抽滤时负压应不大于50kPa。抽滤完毕后，用镊子小心地取下滤膜，将其对折（有藻类样品的一面向里），再用普通滤纸吸压，尽量去除滤纸上的水分。如不立即提取，应将滤膜放在黑暗低温条件下保存。在普通冰箱冷冻室中可存放几天，在-20℃低温冰箱中可保存30天。

3、提取研磨可用玻璃研钵。将滤膜剪碎放入研钵，加入90%乙醇溶液7~ 8ml，研磨3~5分钟直至变为匀浆。将研磨后的匀浆移入具塞带刻度的离心管中。用少量提取液冲洗研钵或匀浆器，冲洗液并入离心管中，使终容积略小于10ml。盖上关塞，摇动后置于黑暗低温处进行提取至少6-24h。

4、离心将装有提取液的离心管放入离心机中，转速3500~4000rpm，离心10~15min。将上层叶绿素提取液移入定量试管中，再用少量提取液清洗、离心二次取得提取液。将提取液定容到10ml。如果大批样品需同步操作时，可减少离心步骤，直接在提取液中浸泡滤膜6-2 4h，取其清液即可。

5、测定用90%乙醇溶液作为参照液（参照比色皿中盛放90%乙醇溶液，并用90%乙醇调分光光度计零点）。测定定容后的提取液在665nm和750nm处的吸光度，并计算两个吸光度的差记为A1；然后向比色皿中加入1滴1mol/L的盐酸酸化，酸化5—10min(可以用不同时间实验再进行调整)后再次测定酸化后的提取液在665和750nm处的吸光度，并且把酸化后的两个吸光度的差记为A2.则提取液中叶绿素a的浓度为：Chla=27.9×（A1－A2）×V提取液/V脱镁叶绿素浓度为：Chla=27.9×（1.7 A2－A1）×V提取液/V其中Chla为水样中的叶绿素a含量，单位为ug/L；V提取液为提取液的最终定容体积,单位为mL；V为抽滤水样的体积，单位为L。