免疫PCR试验方法
时间：2021-01-25 阅读：434
免疫PCR试验方法
（一）材料与方法
1.*标记特异性抗体的制备 免疫球蛋白(如IgG、IgM)的Fc片段上有糖基存在，因而可用能与糖基结合的Biotin-hydrazide作*标记。
(1) 将纯化的抗体(IgM或IgG， 0.1~1.0ml)在标记缓冲液(0.1Mol/L NaAc，pH值5.5， 0.1Mol/L NaCl)中4℃透析放置一晚。
(2)吸取0.5ml至微量离心管中，加过酸钠溶液至终浓度为10mMol/L，置冰浴上于暗处孵育30min，使抗体分子上的糖基氧化。
(3)将氧化的抗体过PBS平衡的Sephadex G25 PD-10预装柱，使之与过酸钠分开。收集蛋白峰。
(4)向抗体管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至终浓度5mMol/L，置混摇器上室温孵育1h。
(5)用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25预装柱，将*标记的抗体分子过柱与游离的*分开。收集蛋白峰，保存-20℃。
2.*标记DNA片段的制备 作为将与抗体偶联的报告DNA片段，应确保在待测抗原来源的机体DNA中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告DNA去检测人源的标本。DNA片段大小为300~500bp，*标记可采用PCR方法，根据报告DNA的核苷酸序列合成一对引物，其中一个引物的5’端碱基上带有*标记。
在0.5mlPCR管中按表将下列试剂混合。
表PCR系统组成
| 试 剂 | 添加量 | 终浓度 |
| 10×PCR缓冲液 | 10.0ul | 1× |
| 2.5mM 4dNTP混合物 | 8.0ul | 0.2mM |
| 50uM*标记的上游引物 | 1.0ul | 0.5uM |
| 50uM*标记的下游引物 | 1.0ul | 0.5uM |
| 15mM模板DNA | 1.0ul | 1.0ug |
| Taq DNA聚合酶 | 1.0ul | 5U |
加水至 100uL
混匀后上面覆盖液体石蜡。
95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增：94℃ 1min;55℃ 1min;72℃ 1min; 40个循环。后72℃延伸10min。
加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3Mol/L Kac，250uL无水乙醇，置-70℃30min。
离心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。
将沉淀DNA干燥后溶于TE缓冲液中，保存在-20℃。
3.制备抗体-亲和素-DNA复合物 将*标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中，室温孵育30min，再加入两倍分子浓度的*标记的DNA片段，继续孵育30min，后加入10倍分子浓度的*，将亲和素分子上的结合部位饱和。后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开，加入BSA达1mg/ml，分装后冻存于-20℃。
4.免疫PCR
（1） 按常规ELISA方法，用饱和缓冲液稀释抗原，加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中，4℃放置一晚。
（2） 用PBS洗三次，然后每孔加200ul封闭液（PBS含10mg/ml BSA，1mg/ml鱼精DNA），室温孵育30min。
（3） 用TETBS（其配方：20mMol/L EDTA，0.02%NaN3）洗三次。
（4） 将抗体-亲和素-DNA复合物稀释于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml鱼精DNA的TETBS中，每孔加50ul，室温孵育1h。
（5） 用TETBS洗5次，然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。
（6） 每管中加50ulPCR反应液，含有表成分：
| 试 剂 | 添加量 | 终浓度 |
| 10×PCR缓冲液 | 5.0μl | 1× |
| 2.5mM 4dNTP混合物 | 4.0μl | 0.2mM |
| 50uM*标记的上游引物 | 0.5μl | 0.5uM |
| 50uM*标记的下游引物 | 0.5μl | 0.5uM |
| 15mM 模板DNA | 0.5μl | 1.5ug |
| Taq DNA聚合酶 | 0.5μl | 2.5U |
加水至50μL
混匀后上面覆盖液体石蜡。
95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增35个循环：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min。后72℃延伸10min。
每管取5ul作琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后观察结果，如在PCR时加入了放射性核素标记，则可用X光片显影。
亦可在凝胶电泳后做Southern-blot，用特异性探针杂交，进一步提高其特异性和敏感性。
(二)注意事项
本实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将*标记的抗体与*标记的DNA偶联的方法，因每个链亲和素分子可与四个*分子结合，因此要优化反应条件，以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子，又能结合上DNA片段。
此外，还可用化学方法将DNA片段与抗体分子共价偶联，即将抗体分子和5’端氨基酸修饰的DNA片段分别用不同的双功能偶联剂激活，然后通过自发的反应偶联到一起，比如，用N-Succinimidyl-S-acetyl thioacetate(SATA)活化氨基修饰的DNA片段，用Sulfo-Succinimidyl4-(maleimidomethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate(Sulfo-SMCC)修饰抗体分子，然后将二者在一小管中混合，通过加入盐酸胲（Hydroxylamine hydrochloride）使二者偶联在一起。
免疫PCR具有高敏感性。因此，抗体和标记DNA的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能*地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉了，亦可在后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外，应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂，用鱼精DNA做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染，这也是所有敏感的检测系统存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真，重复使用同样的引物和标记DNA均会产生假阳性信号。
免疫PCR的一个优点是标记DNA序列*是人为选定。因此标记DNA及其引物可经常变换，以避免由于污染造成的假阳性信号。
免疫PCR可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此，应用免疫PCR可在微观水平（单细胞）检测抗原，定量PCR产物可以估计某一标本中的抗原数量，在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。