应用FRR叶绿素荧光诱导技术估算有效光反应中心含量
 

　　PSII可与PSI协同从水中获取电子生成还原体、驱动光化学反应和植物营养循环。因此有效PSII光反应中心([PSII]active)的含量可作为植物生产力评估的基础因子，同时也是评估植物光合速率、研究植物胁迫响应的关键。而对于液体样品，[PSII]active含量同样是评估水生生物光合作用速率以及分析浮游植物对胁迫的响应的关键参数。但传统上缺少稳定、可靠、快速的 [PSII]active含量的测量方法。
 

　　本文将介绍加拿大蒙特爱立森大学的Campbell教授的研究------应用FRR叶绿素荧光诱导技术进行[PSII]active含量估算的方法。该方法有效解决了传统测量方法存在的问题。其原理是：在一定体积下：
 

　　a)F’o强度与[PSII]active色素含量相关；
 

　　b)σ’PSII与PSII色素总含量相关。
 

　　因此，F’o/σ’PSII可以代表单位体积的[PSII]active含量。(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)。而这两个参数都可以利用快速饱和及弛豫荧光诱导程序(fast repletion and relaxation (FRR) ?uorescence induction)获得。(注：σ’PSII: 光适应状态下PSII的有效吸收截面；F’o：光适应下的基础荧光。)
 

　　为了证明该方法用于估算[PSII]active含量可靠、可行，即受非光化荧光淬灭影响很小、测量快速并且稳定、具有时间分辨性、可应用于对湖泊和海洋水体的初级生产力的快速评估，该研究进行了209次成对测定，对不同培养和处理条件下的海洋蓝藻、分别在高光和低光处理下的原生态型球藻、北极和温带的绿藻、两种中心硅藻进行测试。
 

　　由于藻类的生理状态对培养密度、光照条件、气体状态、温度、pH值等都很敏感，进而直接影响所得参数和公式的科学性，所以需要精确控制培养条件并实时监测培养状态。因此本研究使用FMT150光养生物反应器对中心硅藻两个藻株分别在2种不同状态下进行培养和监测，精确控制营养浓度、温度、光照，并自动进行恒化培养。在培养过程中仪器自动使用水蒸气饱和的空气气泡混匀，避免沉降。(FMT150光养生物反应器介绍见后附)
 

　　之后使用FL3500(当前升级为FL6000)测量每个样品的F’o和σ’PSII，用以计算[PSII]active。FL3500可自动控制和测量样品温度、预施光照、光化光、单周转饱和光闪、QA再氧化等8种默认测量程序、精确自定义程序等。
 

　　同时使用荧光光纤氧气传感器测量密闭比色皿里样品的溶氧浓度。氧气的测量可由仪器自带软件程序自动控制。
 

　　放氧测量过程如下图所示：在FRR测量过程中，氧气浓度随激发光变化并与时间(横轴)相对应。将氧探头固定在FL3500自动控温探头上，一同插入FL3500测量单元内的待测样品中。FL3500具有磁力搅拌功能，该功能可由触控面板控制，也可由FL3500自带软件FluorWin程序精确定义。
 

　　在初始300s的暗适应过程中记录氧气浓度作为暗呼吸值；之后用低光(20 µmol.m-2.s-1)进行预光照激活光系统并测量氧气；在一个FRR程序结束后立刻测量氧气浓度作为在FRR过程中的呼吸。二者差值用于估算样品中[PSII]active含量。
 

　　之后将样品置于光下300 s；再次进行FRR诱导(见下图)并测量氧浓度。再次估算样品中[PSII]active含量。公式为：
 

　　μmol PSII L-1=μmol O2s-1L-1×(25.025×10-3s Flash-1)×(4 Flash 1×1 PSII/O2)
 

　　FRR测量过程如下图所示：*行300 μs的暗适应。预光照之后使用40个(间隔2 μs)单周转光闪(1.2 μs， µmol.m-2.s-1)的激发序列进行FRR诱导，以逐渐关闭全部PSII；在这个过程中得到Fo、FM、σPSII、ρ(表示PSII 光反应中心的连通性)。之后降低光闪重复速率，PSII逐渐打开，此过程持续0.25 s。黑暗2 s，PSII打开。再施加第二次FRR诱导，得到F’o2、F’M2s、σ’PSII2s……
 

　　使用放氧法得到的[PSII]active对FRR得到的 [PSII]active=F’o/σ’PSII 公式进行校正，得到校正参数。
 

　　本研究验证了前人(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)的假设，应用FRR测量得到的[PSII]active矫正公式适用于本文所述所有藻类样品，包括：呈指数增长的样品、短期生理波动的非稳态样品、光抑制样品、低浓度样品、光适应下的样品，并且受非光化荧光淬灭影响很小。
 

　　因此可以用FRR测量程序来估算湖泊和海洋不断变化的环境中的初级生产力。
 

　　本案例文献： Murphy C. D., Ni G., Li G., et al. (2016) Quantitating active photosystem II reaction center content from fluorescence induction transients. Limnol. Oceanogr. Methods. DOI:10.1002/lom3.
 

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