Biotek核酸定量原理及解决方案
时间：2020-11-10 阅读：417
核酸定量原理：
DNA/RNA 的分光光度法测定
DNA 或RNA 的分光光度法测定核酸的定量是分光光度计使用频率的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL 的dsDNA，37μg / mL 的ssDNA， 40μg/mL 的RNA，30μg/mL 的寡核苷酸。为了保持定量结果稳定，样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）要求吸光值在0.1-1.5 A。
分光光度计显示的比值表示样品的纯度，蛋白的吸收峰是280 nm，纯净的样品260/280 nm比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。假如比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、酚盐离子或硫氰酸盐等，较纯净的核酸A260/A230 的比值大于2.0 。A320 检测溶液的颗粒度、混浊度和其他干扰因子。纯样品的A320 一般是 0。水饱和酚在270nm 处有特征吸收，无酚的核酸制品A260/A270 比值约为1：2。
DNA/RNA 的荧光测定
用荧光测定法分析核酸浓度操作简便而且比分光光度法灵敏，可测定纳克级水平的DNA。Hoechst33258 对小分子DNA 的结合能力较弱，这种方法只能用来测定长度超过1kb的DNA 溶液的浓度。测定时，将浓度已知和未知的DNA 制品与荧光染料保温，把未知样品的吸收值与一系列浓度已知样品的吸收值相比较，得未知样品的浓度。
Picogreen 染料是一种新型的dsDNA 染料：其检测灵敏度高，可检测到pg 级DNA；检测范围宽，可跨越４个数量级；特异性好，基本不受ssDNA 和RNA 的影响，并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰。目前使用Picogreen 染料定量检测DNA 已经广泛用于生物学检测，并被2010 年版《中华人民共和国药典》选为药物残留DNA 定量方法。
当样品DNA 含量不足以通过分光光度法测定，DNA 严重污染有吸收紫外射线的其他杂质而妨碍准确测定，一个快速的办法是利用溴化乙锭嵌入DNA 分子中后由紫外激发的荧光来估测这种样品中DNA 的含量。由于荧光强度与DNA 总量成正比，可通过比较样品和一系列标准溶液产生的荧光估测DNA 含量。
RiboGreen RNA 定量试剂是一种超灵敏的核酸荧光染料，使用这种染料可以对溶液中的RNA 进行简单快速的定量。当RiboGreen 荧光染料处于溶液状态时，其几乎没有荧光活性；当RiboGreen 与RNA 结合，其荧光活性将增加1000 倍。RiboGreen-RNA 复合物的荧光激发波长约500nm，发射波长约525nm。使用RiboGreen 荧光染料可以检测到2.5ng/mL 的RNA，这比260nm 吸收法要高出千倍。
Biotek核酸定量解决方案
对于样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过微孔板分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确，使用Biotek—Eon、Epoch、Epoch2微孔板分光光度计可以得到精确的数据，并且可选配Take3微量检测板进行高通量超微量核酸定量，多一次48个样品、少上样量2μl。
对于样品中DNA 或RNA 含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量，使用Biotek——FLX800、SynergyH1、HTX等进行精准的荧光核酸定量，并可配备Take3进行高通量超微量荧光核酸定量实验。
在荧光检测模式下，染料特异性的滤光片和带宽选择，可以为所有应用提供的检测灵敏度，无论采用何种荧光染料进行标记，光路系统均可以的适应其光谱特性
BioTek产品以灵敏度高、重复性好、操作简便等深得用户信任，无论是哪种定量方法，Biotek总能提供准的数据，为您实验室核酸定量保驾护航。
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