非甾体抗炎药(non -steroid anti- drugs, NSAIDs)是药物性肝损伤见的原因。特别是双氯芬酸（Diclofenac）类药物，常用于治疗慢性疼痛和炎症性疾病，2009年FDA就其潜在的肝毒性效应发出警告。

进行肝毒性研究，体内模型实验既昂贵又耗时，而使用原代肝细胞的体外筛选成本更低，且易于进行高通量检测。一项典型的毒性研究在数天内反复给培养的肝细胞加药，以评估累积效应。然而，2D培养条件下的肝细胞很难形成细胞-细胞和细胞-基质通信网络，且2D培养条件将导致原代肝细胞快速去分化和代谢能力降低。这些缺陷限制了目前肝毒性研究的范围，并妨碍对药物在体内累积和长期影响的真正理解。

在本文介绍的研究中，基于BioTek的Cytation高通量细胞成像平台，对比了2D和3D培养条件下Diclofenac对肝细胞的毒性，并证实了Diclofenac肝细胞毒性的作用机制。

3D肝脏微组织的Diclofenac细胞毒性研究结果

如图1所示，在Diclofenac给药剂量范围内，3D肝脏微组织细胞总数相对稳定，而死亡细胞数量在给药期间随着Diclofenac浓度的增大而增加。

图1. 3D培养条件下，Diclofenac肝毒性实验结果。X轴-给药时间，左Y轴-总细胞数和死亡细胞数，右Y轴-细胞死亡率

3D肝脏微组织的成像结果（图2）直接证实了这一点。这表明，在检测化合物的潜在细胞毒性时（尤其是在长期给药评估期间）3D微组织是一个可行的选择。

图2. 3D肝脏微组织细胞毒性成像结果。Diclofenac治疗10天后3D肝微组织的代表性图像，Hoechst 33342（蓝色）标记所有细胞，CellTox Green（绿色）标记死亡细胞，分别使用Cytation的DAPI和GFP成像通道自动捕获。

此外从图1结果可以发现，使用300μM Diclofenac直到第三天才出现明显的细胞毒性。而此前公布的数据显示，200 - 450μM Diclofenac 24小时内即可观察到明显的细胞毒性。这种对比差异强调了使用3D细胞模型进行细胞毒性研究的必要性。

2D肝细胞的Diclofenac细胞毒性研究结果

如图3所示，与对照组相比，Diclofenac浓度时的总细胞数和死亡细胞数均降低，细胞死亡率保持不变或低于对照组，这与预期相反。

图3. 2D培养条件下，Diclofenac肝毒性实验结果。X轴-给药时间，左Y轴-总细胞数和死亡细胞数，右Y轴-细胞死亡率

图4成像结果证实，随着Diclofenac浓度增大，越来越多的细胞死亡，并且已经从板底脱落，因此检测到的总细胞数和死亡细胞数均降低。这种现象使得2D细胞培养下的分析变得复杂，进一步支持将3D细胞培养模型纳入长期细胞毒性评估。

图4. 2D培养条件下，肝细胞毒性成像结果。Diclofenac治疗10天后肝细胞的代表性图像，Hoechst 33342（蓝色）标记所有细胞，CellTox Green（绿色）标记死亡细胞，分别使用Cytation的DAPI和GFP成像通道自动捕获。

证实Diclofenac细胞毒性作用机制

在细胞毒性评估的同时，监测线粒体氧化应激和线粒体渗透性转换（Mitochondrial permeability transition，MPT）孔开放情况，以证实Diclofenac肝细胞毒性的作用机制。

如图5所示，随Diclofenac浓度增大，红色荧光信号显著增强，表明超氧化物水平升高。这与之前发表的数据一致，显示Diclofenac的细胞毒性是ROS形成的结果。

图5. Diclofenac给药3天后，线粒体氧化应激评估结果。Hoechst 33342(蓝色)标记所有细胞，MitoSOX Red(红色)标记线粒体超氧化物，分别使用Cytation的DAPI和RFP成像通道自动捕获。

如图6所示，随着Diclofenac浓度增加，绿色荧光信号的显著减弱，表明线粒体氧化应激的增加也导致了MPT孔开放。

图6. Diclofenac给药7天后MPT诱导评估结果。Hoechst 33342(蓝色)标记所有细胞，MitoTracker Red(红色)标记活细胞线粒体，Calcein(绿色)标记细胞内钙离子，分别使用Cytation的DAPI、RFP和GFP成像通道自动捕获。

本研究结果表明：在2D培养条件下，由于肝细胞从微孔板的底部脱落，使细胞计数变得复杂。与传统的2D培养相比，3D微组织对毒素的反应较弱，这表明3D培养的细胞-细胞和细胞-基质通信创造了一个更适合长期监测的细胞培养系统。结合3D细胞培养模型和BioTek的Cytation高通量成像平台，可以快速获取准确可靠的可重复结果。

本文内容涉及的检测仪器：

BioTek Cytation系列（长按二维码获取更多详细介绍）

Marcus Ruscetti, Josef Leibold, Matthew J. Bott, Myles Fennell, et al. NK cell–mediated cytotoxicity contributes to tumor control by a cytostatic drug combination [J]. Science, 2018.

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