CESI 8000-AB SCIEX TripleTOF 5600+系统对生物制品的快速表征
时间：2020-11-09 阅读：789
CESI 8000-AB SCIEX TripleTOF ® 5600+系统对生物制品的快速表征
单克隆抗体（mAbs）已逐步成为当前药物行业中的一类重要的生物治疗药物。目前已经批准的治疗性单抗药已有三十多种，用于治疗不同种类的癌症、自身免疫性和传染性疾病。单抗和类单抗分子的治疗性药物，如双特异性抗体、 单链可变区片段（scFv）和抗体药物结合物（ADC）的生产也正在扩大。随着原研药物即将到期，很多单抗仿制药和改良药也正在开发中。因为氨基酸序列的改变、质量属性的修饰、糖基化等翻译后修饰可能会影响治疗效果、生物利用度和安全性，因此，对单抗和其替代品进行更全面的表征十分必要。
毛细管电泳技术拥有多种*的分离分析模式，如毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等电聚焦（cIEF）和毛细管SDS凝胶电泳（CE-SDS），很多生物制药行业已经利用毛细管电泳技术结合紫外吸收或荧光信号的检测手段表征单抗的纯度和异质性。多项研究表明，毛细管电泳技术在不同的操作者及不同的实验室间表现出良好的稳定性和方法的可转化性 1,2 。毛细管电泳技术杰出的高效分离能力配合质谱的鉴定能力可用于单克隆抗体第三级层面的修饰和降解的表征分析。一些重要的属性,如肽谱序列、脱酰胺化、异构化、环化和糖基化等翻译后修饰，只能通过肽谱分析对其进行检测、定位和定量分析。
为了实现这个目标，AB SCIEX分离分析部门将毛细管电泳技术（CE）和电喷雾离子化（ESI）整合在一个动态的过程中，我们称之为CESI。这一技术是由Moini等人 3 首先提出的，而后贝克曼库尔特公司改进并设计推出了高效分离电喷雾离子化系统CESI 8000 4 。本文通过对代表性的单克隆抗体药物*（赫赛汀）的全面表征，来展现CESI与高分辨质谱联用技术的优势。本文的研究是Gahoul等人在mAb杂志上发表的相关工作的延伸 5 。使用CESI技术，在对100 fmol的*酶解样品的单次分析中，可分离3-65个氨基酸范围的大小不同的多肽，鉴定肽段的序列覆盖度达到100%并可对天冬酰胺脱酰胺、蛋氨酸氧化、*环化和末端赖氨酸的异质性等降解热点进行定量分析。该系统的超低流速（20 nL/min）大化了离子化效率、降低了离子抑制效应。
CESI-MS技术的优势
CESI提供了和LC/MS正交的分离机理，用于分离、鉴定、定量、以及确认序列变异和翻译后修饰。CESI超低的流速对大化离子化效率和减少离子抑制效应有很大的优势，尤其是糖肽这类强电离的亲水性物质。毛细管电泳技术固有的高分离效率可以提供尖锐的肽峰，高灵敏、高重现性的进行鉴定和相对定量分析。CESI无需任何固定相而采用开放式通道分离，所有的肽段（疏水性和亲水性）都可以从毛细管冲洗脱出来，可得到*的抗体序列覆盖度并从根本上消除样品损失和残留问题。基于100 %的肽谱序列覆盖度的分析结果，使用一种蛋白酶（*）的单次酶解单次CESI 运行即可以得到单抗纯度、稳定性、糖基异质性的定量定性的表征信息。在60分钟的分离中，肽段的迁移时间变化小于30秒（≤0.83% RSD），修饰和未修饰的肽段的相对丰度数值变化小于2%。
实验设计
样品准备：用Rapigest溶解100 μg*，然后进行DTT的还原和IAM的烷基化处理，得到的样品在37℃经过*酶解过夜，进行干燥，用300 μL 的醋酸铵（133 mM，pH4）回溶，得到终浓度为0.33 μg/ μL抗体酶解产物。取50 μL用于进样分析。
CESI-MS和CESI-MS/MS：分析所用仪器是AB Sciex的CESI 8000，分离所用的是30 μm ID x 90 cm的熔融石英毛细管，安装在OptiMS CESI的卡盒中，冷却液的温度设置为25 ℃。连接AB Sciex TripleTOF ® 5600+质谱仪。用100 mM的前导电解质溶解样品，使50 nL样品（相当于100 fmol的单抗酶解产物）进入熔融石英毛细管并在瞬时等速电泳下进行分离前的浓缩。以10%的醋酸作为背景电解质，分离电压为20 kV。在电场的作用下，待测物根据其电荷/体积比在毛细管中迁移，终到达毛细管的喷口端，通过ESI源进入质谱。
信息依赖采集(IDA)是通过高分辨的TOF MS作为预扫描，同时触发多个MS/MS扫描进行数据采集的模式。IDA的参数设置如下：TOF MS预扫描的时间100 msec，IDA标准选择强度超过200 cps的头30个离子进行MS/MS扫描，扫描时间均为50 ms，选择变化的碰撞能量诱导碎裂，动态排除时间为10 s，总扫描时间1.8 s。优化的IDA参数，保证质谱的扫描速度能很好的满足CE的快速分离。在CE-MS批次进样中，使用自动校正功能，每三个样品自动校正一次，保证高的质量准确度。
数据分析：用BioPharmaView™、ProteinPilot™ 和 PeakView ®进行数据的分析，必要时采用手动操作确认。
结果与分析
虽然一些单克隆抗体已被批准商品化，但极少像*一样经过全面地表征。本工作采用自下而上（bottom-up）的分析方法，对*使用单一*进行酶解产物分析。针对所有的生物制品发展“通用”的酶解方案，将大大简化样品制备，同时有助于克服基体效应。从工作流程效率的角度来看，使用单一酶有利于多个蛋白样品平行分析结果的比较，也可消除不同酶酶解效率可能有所不同所引起的差异。
图1描述了*酶解的*的CESI-MS分析结果，上面的谱图显示的是基峰谱，中间的图谱可以看到IDA选择的母离子，这些所有m/z范围内的离子可提高更多肽段被识别的概率。这些离子通过MS / MS分析，可以更确定的鉴定*解的肽段，包括非常小和非常大的肽段（大达63个氨基酸），如图1下面的谱图所示。开管式的毛细管由于减少管壁的相互作用可以无歧视的检测亲水性和疏水性的肽段。
图1. *酶解*的CESI-MS分析结果，a）基峰电泳图；b）母离子m/z随着时间的分布；
c）肽段氨基酸数量对肽段迁移时间的分布。
实现100%序列覆盖度
图2描述了用ProteinPilot™展示的蛋白全序列覆盖度。上面和中间的图分别描述了重链和轻链的序列信息。手动确认蛋白数据库搜索参数之外（灰色序列部分）的短肽序列（下图）。使用这种组合的方法，可以得到*LC和HC的100%氨基酸序列。上图和中图显示的两组肽段并分别确认为单抗的LC和HC。短肽的验证可以通过后续的MS/MS来实现。通过每一个CESI-MS的分析可以得到100%的序列，只用单一的*进行酶解和60 min的分离表明了毛细管电泳的优势，图2下图进一步说明了对于小肽段毛细管电泳技术分离的出色优势。
图2. CESI 8000-AB Sciex TripleTOF ® 5600+数据搜索结果和100%*重链和轻链的覆盖度。
降解热点分析
图1所示的高分辨率的电泳峰可以比较肽段的质量分布，例如可结合CESI高分离能力和MS的高分辨率在质量维度提取肽峰的面积。为了能更好的表明CESI-MS的能力，图1中概述了*中肽段的降解热点的鉴定和定量，如焦*的形成（氨基末端*环化）、蛋氨酸氧化和C-末端赖氨酸损失。还有一些丰度较低的PTMs，如赖氨酸糖基化和/或*脱氧也被鉴定,但是由于很少量我们没有在此讨论。对提取离子电泳图（EIES）进行分析，可以确定降解热点的存在，这些降解热点在单克隆抗体处理和储存过程中发生。N端氨基修饰可以导致*环化反应形成焦*。焦*的形成将提高抗体在体内的半衰期，它是生产过程的控制指标。MS/MS图显示了相差18 amu的环化和未环化的肽段。提取离子数据表明环化产生的焦*含量仅为3.26 %（图3）。焦*环化会导致失去一个正电荷，使得环化的肽段在电泳中迁移慢于未环化的肽段。这个修饰的变化可以在CESI中进行很好的分离，进而通过MS/MS获得结构的确认（图3）。
在单克隆抗体的生产和存储中，蛋氨酸（Met）氧化是另一种常见的修饰，它会导致抗体的稳定性和生物活性的下降。分析提取离子数据显示氧化可发生在重链Met255和Met83位点（表1），并且在*样本中两个位点都发现存在修饰和和未修饰的蛋氨酸。MS/MS分析离子（图4）可以确认蛋氨酸氧化修饰前后分子量相差16 amu。提取离子电泳图可确定MetOx255和MetOx83的相对丰度分别为1.56 %和1.14 %。
提取离子分析的数据表明，相当一部分Asp会发生脱酰胺化，特别在重链的Asn55、Asn387、Asn392、Asn393和轻链的Asn30和Asn152位点。 MS/MS可以通过1 amu的差异检测到脱酰胺化的存在（图5）。在CESI中根据电离效应更容易对其进行分离，这是CESI很重要的优势，而在LC/MS中这两种肽段很有可能一起洗脱出来。此外，对于仅相差1 amu的多肽，即使使用高效的MS和MS/MS，其同位素数据也会重叠从而被自动的鉴定软件错误的鉴定，而CESI-MS可物理分离这些多肽，从而可解决这个对LC/MS具挑战的问题。
在图6中所描述的是C-末端赖氨酸的异质性分析。由于赖氨酸在重链上损失一个正电荷，在CESI中会有明显的迁移变化。从提取离子电泳中可以测得，超过99 %的重链存在C-末端赖氨酸损失。
图3. 环化和未环化的N-端肽段的提取离子数据。
表1. *降解热点的鉴定。
图4. CESI-MS分析255和83位点上的蛋氨酸氧化。
图5. CESI-MS对天冬酰胺脱酰胺位点的鉴定。
图6. CESI-MS对C端赖氨酸异质性的分析。
糖肽谱分析
糖基化是对单克隆抗体相关功能有重要影响的翻译后修饰。特定糖基的存在与否可影响单抗的有效性、稳定性和免疫原性。*具有一个保守的糖基化位点：重链的Asn300。很多种糖基可以连接在这个位点上。由于单抗是由两条重链组成，存在着不同的糖基的结合，导致了单抗结构的复杂性。在CESI中，糖肽实现了很高的离子化效率，产生很强的信号，能够在MS/MS中检测到含量极低的糖肽。由于结构的不同，糖链在电泳中的迁移也不同，因此迁移时间可用于辅助糖肽的结构鉴定。由于在CESI-MS的分离中，*解的肽段保留了与其连接的糖基，通过特定氨基酸的连接可以对发生在Asn300的位点上的连接进行确认。表2A和2B显示了*样品中，在EEQYNSTYR肽段上鉴定出14个不同的糖型（图7A），在TKPREEQYNSTYR肽段上鉴定出7个糖型（图7B）。糖型的丰度从47 %到低至0.29 %。将近一半的糖肽属于低丰度糖肽，但仍然可以离子化并在CESI-MS上检测到。利用毛细管电泳技术分析寡糖的技术早已非常成熟，根据不同糖链的电荷/质量之比值的不同对其进行分离，可以从另一个维度提供对糖型的确认（图7）。与分析降解的PTM相似，运用CESI-MS进行糖肽的分析也具有很多的优势。首先，在nL/min的流速下，糖肽可和其他多肽一样用更充分的离子化， 得到全面的表征和高动态范围的鉴定。另外，在LC/MS中共洗脱的糖肽，可在CESI-MS中可以被分离。根据糖肽的迁移时间不同可以确认糖基的结构。正如预期一样，迁移时间越大，则肽段上所连糖基的大小和负电荷也越大。根据电泳图中的肩峰或非高斯型峰可确定非目的糖基碎片。因此通过CESI-MS对糖肽的分离，增加了分析糖基表征的灵敏度和准确度。
结论
在本文中，我们举例说明了使用CESI-MS和AB Sciex TripleTOF ®5600+平台对治疗性单克隆抗体药物曲妥珠的快速表征。从高效的样品制备开始，使用单一的酶解过程，通过单次分离步骤，能够快速获得100%的单克隆抗体重链和轻链的序列覆盖率。此外，可阐明关键的氨基酸修饰如*环化、蛋氨酸氧化、天冬酰胺脱酰胺化和C-末端赖氨酸的异质性。在同一次CESI-MS分析中，还可同时得到糖肽的分析结果，可以在低丰度的情况下识别糖-氨基酸连接位点上多达14个不同的糖型。强离子信号提供的准确质量数测定和进一步的MS/MS分析，结合电泳中结构相关的分离，可极大简化糖型的鉴定和确认。CESI-MS的超低流速，可以极大的提高糖肽这类难电离物质的检测灵敏度。与快速精确的MS平台如TripleTOF ®5600+相结合，单次酶解和单次CESI-MS分析即可有效地提供对单克隆抗体药物的表征信息。
图7A. CESI-MS鉴定EEQYNSTYR肽段上的糖基化结构，更多糖肽的信息在表2B。
图7B. CESI-MS鉴定TKPREEQYNSTYR肽段上的糖基化结构，更多糖肽的信息在表2A。
表2A. *重链TKPREEQYNSTYR肽段糖基化位点N300的结构表征和相对定量。
表2B. *重链EEQYNSTYR肽段糖基化位点N300的结构表征和相对定量。
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