IHC免疫组化实验垃圾和分类知多少？古朵新闻@
时间：2020-04-10 阅读：295
*，Western blot(WB)和免疫组化(IHC)都属于免疫学常用的实验技术。WB是通过SDS-PAGE分离蛋白质样品，然后转移到固相载体上，利用抗原与抗体特异性结合的原理进行样品检测，可用于定性和半定量。而IHC是融合了免疫学原理(抗原抗体特异性结合)和组织学技术(组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等)，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，对组织(细胞)内抗原进行定位、定性及通过Image J进行定量的研究(主要是定位)。与WB相比，IHC实验步骤复杂，涉及的试剂和物品种类繁多，所以IHC的垃圾分类更要认真对待。那么，IHC实验中的垃圾到底有哪些？又该如何分类呢？古朵小编从IHC的实验步骤开始和大家逐一叙述。
IHC(石蜡切片)都有哪些步骤
一、 石蜡组织切片制作
固定：使组织样本尽量保持其离体前状态，多采用4%多聚甲醛固定液。
脱水：水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。使用梯度乙醇进行脱水。75%、85%、95%、*、*乙醇，每步1h-2h左右。
透明：乙醇不能与石蜡相溶，还需用能与乙醇和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的乙醇。二甲苯是常用的透明剂，可以很好地与石蜡互溶。将组织依次放入二甲苯与无水乙醇的等体积混合液、纯二甲苯和纯二甲苯中进行透明。
浸蜡与包埋：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用，便于在切片机上夹持切片。用于包埋石蜡的熔点在50~60℃之间。
切片：将包埋组织的蜡块固定在切片机上，切片厚度一般为4~8μM。
贴片：把切片放入50℃水中，摊平后用多聚赖氨酸处理过的载玻片捞起，室温晾干。
二、 脱蜡复水
干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染液中进行染色。如果不经过复水，直接进入染色剂中，材料将会严重变形，甚至难以染色。
先烤片，将切片放于60℃烘箱中烘烤。
二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10~15min。
放入*、*、95%、85%、75%等梯度乙醇溶液中各3min。
放入蒸馏水洗两次×5min。PBS(或PBST)洗三次×3 min。
三、 抗原修复
甲醛的固定使细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色前需进行抗原修复或暴露。
将切片浸入0.01M柠檬酸盐缓冲液中，再放入微波炉中加热10 min，之后冷却切片。或者，用EDTA-*消化液37℃消化10 min。
PBS(或PBST)洗三次×3 min。用吸水纸将切片组织周围擦干。
四、 灭活内源性过氧化氢酶
去除组织中的内源性酶催化底物，避免染色的非特异性。
用免疫组化笔圈出样品，滴加3%*孵育10min。
PBS(或PBST)洗三次×3 min。
五、 封闭
为减少背景产生的非特异性染色，使用非免疫动物血清进行封闭。
滴加动物血清封闭液，室温封闭30min。
甩去多余液体，用吸水纸将切片组织周围擦干。
六、 抗体结合
滴加一抗，4℃孵育过夜。
PBS(或PBST)洗三次×3 min。
滴加辣根酶标记的二抗，37℃孵育30min。
PBS(或PBST)洗三次×3 min。
七、 底物显色
DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度，然后PBS或自来水冲洗1min。
八、 复染
衬托出组织细胞的形态结构，更好地对目标蛋白进行定位。
苏木素复染1-3min。
PBS或自来水冲洗1min。
九、 分化
1%的盐酸酒精分化2～3秒，PBS或自来水冲洗两次×5min。
十、 脱水和透明
75%，85%，95%，*，*的乙醇浸泡各2min。
二甲苯浸泡两次×2min。
十一、 封片
用盖玻片和中性树胶进行封片。之后镜检。
IHC(冰冻切片)实验怎么做
一、冰冻
将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2cm)，如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
注意：针对储存在-80℃温度下的组织，切片前，从冷冻柜中取出组织样品，在-20℃的温度下均衡约15分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。
二、切片
用OCT包埋剂浸没组织。将组织切成厚度在6-8μm之间的切片，置于多聚赖氨酸粘附的载玻片上。固定前，将切片放置在工作台上风干几分钟(这样可以增加切片的粘附作用)。
三、固定
选择适宜的固定剂，可采用丙酮固定，-20℃下冷冻10分钟，风干。
之后，同上面实验步骤：灭活内源性过氧化氢酶→封闭→抗体结合→底物显色→复染→分化→脱水透明→封片→镜检。