安捷伦液相色谱仪测定小麦中内源激素

植物激素对植物的种子萌发、生长、开花、成熟、衰老、休眠等生命活动起直接或间接的调节、控制作用。小麦是我国三大农作物之一，如 何 调 控 其生长发育，进而促 进 分 蘖，提高产量和品质，备 受 农业科研 人 员 的 关 注。了解小麦内源激素的变化规律，对于研究其产量和抗性等具有重要的生产实践价值。

本文研究对小麦中的ＩＡＡ、ＡＢＡ、ＧＡ３、ＺＴ、ＳＡ进 行 分 离 和 测 定，建立一种分析小 麦 激 素 的 有 效 方 法，从 而 为 小 麦 内源激素调节和控 制 小 麦 的 生 长、衰老等研究提供关键技术。

１实验部分

１．１仪器与试剂

Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高 效 液 相 色 谱 仪，Ａｇｉｌｅｎｔ１２００系列泵，可变波长检 测 器，ＴＵ１８１０紫外可见分光光度计，ＲＥ－５２Ａ旋转蒸 发 仪，３２０－ＳｐＨ计，ＨＲ－１２０电 子 天 平，ＫＱ５００ＤＥ型 超 声 波 脱 气，ＢｅｃｋｍａｎＡｌｌｅｇｒａ６４Ｒ冷冻离心机。

玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸、水杨酸标准品（纯 度≥９９％），甲 醇、乙 酸（色 谱级），石 油 醚、乙 酸 乙 酯（分 析 纯，国 药 集团化学试剂有限公司），实验用水为超纯水。所有试剂在使用前均用０．４５μｍ微孔滤膜过滤。

１．    ２标准溶液的配制

用甲醇配制０．２ｇ／Ｌ生 长 素、０．１ｇ／Ｌ玉 米 素、０．１ｇ／Ｌ脱落酸、２．５ｇ／Ｌ赤霉素、０．４ｇ／Ｌ水杨酸的混合标准溶液。

１．    ３样品前处理

称取新鲜小麦叶２ｇ、根５ｇ，分别加入１０ｍＬ预冷的８０％（如无特殊说 明 均 为 体 积分 数）甲 醇，冰浴研磨成浆，保鲜 膜 密 封 后 于４°C冷 浸 过 夜。然 后于４°C条 件 下以８０００ｒ／ｍｉｎ离 心１０ｍｉｎ得 上 清液，残渣加入８ｍＬ８０％的 冷 甲 醇 离 心１０ｍｉｎ后 合并上清液。全部滤 液 于４０°C下减压浓缩至原体积的１／３，加 入３０ｍＬ石油 醚 萃 取 脱 色３次，弃 醚 相。水相用２０ｍＬ乙酸乙 酯 萃 取３次，合 并 酯 相，４０°C下减 压 蒸 干。加 入ｐＨ３．５的 乙 酸 溶 液２ｍＬ，过Ｓｅｐ－ＰａｋＣ１８小柱纯化，用甲醇洗脱，收集后在４０°C下减压浓缩至干。用流动相溶解并定容至２ｍＬ，经０．４５μｍ微孔滤膜过滤后进行ＨＰＬＣ分析。

１．    ４色谱条件色

谱 柱 为ＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ－Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ公 司），流 动 相Ａ为 甲 醇，Ｂ为乙 酸 的 水 溶 液（ｐＨ３．６），梯 度 条 件 为０～７ｍｉｎ２０％Ａ，７～１０ｍｉｎ２０％Ａ～２８％Ａ，１０～１７ｍｉｎ２８％Ａ，１７～１９ｍｉｎ２８％Ａ～４０％Ａ，１９～３５ｍｉｎ４０％Ａ。流 速 为１ｍＬ／ｍｉｎ，进 样 量 为１０μＬ。检测 器 波 长 设 置 为２５４ｎｍ；１４．５ｍｉｎ时 切 换 到２４０ｎｍ；ＳＡ洗脱 后 即１８ｍｉｎ时 切 换 回２５４ｎｍ。检测温度为室温。

２结果与讨论

２．    １样品处理条件的优化

由于水杨酸含量低且易被ＰＶＰＰ吸附，选择Ｓｅｐ－ＰａｋＣ１８小 柱 纯 化。对５种激素提取效果良好。

２．２色谱条件的选择

２．２．１流动相梯度

综 合 考 虑 各 激素分离度、峰形的对称性以及缩短分析时间，zui终采用１．４节所述的梯度洗脱条件。

２．２．２流动相的ｐＨ

选 择ｐＨ３．６的 乙酸的水溶液为 流 动 相Ｂ，各峰的分离度以及保留时间都较好。

2．２．３检测波长

选 择 在ＳＡ出 峰 前（１４．５ｍｉｎ）将检测器波长 切 换 到２４０ｎｍ，待 出 峰 *结束后（１８ｍｉｎ）切回２５４ｎｍ（图１ｂ）。切 换 波 长 更 利于 待 测 组 分 的 分析 检 测。

２．２．４流速

流 速 为１ｍＬ／ｍｉｎ时，各激素能在３５ｍｉｎ内很好的分离。在优化的色 谱 条 件下，对混合的标准样品进行检测。５种 激 素 能 够 较 好 地 分离和检出。

2.３标准曲线及其线性范围

以５种激素的标准溶液为原液进行逐级稀释，在优 化 的 色 谱 条 件 下 分 析。以峰面积为纵坐标（ｙ），质量浓度 为 横 坐 标（ｘ，ｍｇ／Ｌ），计 算 各 内 源 激素的回归方程、相关系数和线性范围，同时按３倍信噪比得到 各 激 素 检 出 限（见 表１）。由 结 果 可 知，标准品浓度与峰面积的相关性良好。

2.   ４回收率的测定和实际样品分析

取小麦根样品２ｇ，按照１．３节方法制备样品并用上述条件进行 测 定。如 图３所 示，小麦 根 中 的 激素能得到很好 的 分 离。随 后 进 行 加 标 回 收 试 验，结果见表２。

３结论

通过优化小麦中５种内源激素的提取条件以及色谱条件，建立了一种简单、有效的液相色谱分析方法。分离效果理想，加 标 回 收 率 达９６％～９８％，检出限为０．１９５～０．９７６ｍｇ／Ｌ。方法满足激素 定 量分析的测定要求，为进一步检测小麦生长过程中内源激素的变化、激素代谢与小麦的生长、衰老等相关性研究提供了关键技术。