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　　戈氏放线菌PCR试剂盒说明书
 

　　产品名称：戈氏放线菌PCR试剂盒
 

　　产品规格：50T
 

　　原理是由一对引物介导，能在动植物体外对特定基因(DNA)片断进行快速酶促扩增，经过n个热循环扩增，扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n(0

　　特异性强
 

　　PCR反应的特异性决定因素为：
 

　　①引物与模板DNA特异正确的结合；
 

　　②碱基配对原则；
 

　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
 

　　④靶基因的特异性与保守性。
 

　　产品特点：
 

　　本产品就是根据保守区设计引物而开发的高灵敏荧光定量 PCR 产品。
 

　　具有下列特点：
 

　　1.根据 指标的保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
 

　　2.灵敏度比常规 PCR 高 2-3 个数量级，可以达到几百拷贝/反应。
 

　　3.即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。
 

　　4.一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。
 

　　5.本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
 

　　6.本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
 

　　规格及成分                            成分
 

　　2×qPCR MagicMix                 500 μL(装 A 袋)
 

　　微量核酸稀释液(荧光 PCR )1 mL(装 A 袋)
 

　　PCR 引物混合物                        100 μL(装 A 袋)
 

　　基因阳性对照                           50 μL(装 B 袋)
 

　　DNA 病毒裂解液(试用装)       15 次(9 mL)
 

　　使用手册                              1 份
 

　　运输及保存：低温运输、-20℃保存(A 袋试剂放样品准备区、B 袋的阳性对照好分开放置)，
 

　　自备试剂DNA 模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。
 

　　应用案例
 

　　戈氏放线菌PCR试剂盒样品 DNA 的制备
 

　　1.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装(一管式病毒 DNAout 的成分)。
 

　　稀释阳性对照(以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的长为 86bp 的 DNA 片段作为阳性对照。
 

　　2.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
 

　　3.用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液(好用带芯枪头，下同)。
 

　　4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。5.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
 

　　6.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
 

　　7.换枪头，在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中，得1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。8.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
 

　　设置 qPCR 反应(20  μL 体系，在样品制备室进行)
 

　　9.在 PCR 管中加入下列成分(待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加)：
 

　　注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。
 

　　10. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行
 

　　优化)。
 

　　过程温度时间
 

　　预变性95℃1 分钟
 

　　PCR 反应95℃15 秒
 

　　(30 个循环)60℃15 秒
 

　　72℃15 秒
 

　　11.戈氏放线菌PCR试剂盒 数据采集
 

　　具体操作按所用仪器*的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时，
 

　　大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的大吸收光谱在 500 nm，大发射光
 

　　谱在 530 nm。
 

　　四、数据处理
 

　　12. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品
 

　　的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
 

　　组成及试剂配制:
 

　　1、酶标板：一块(96孔)
 

　　2、 标准品(冻干品)： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)，分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
 

　　3、 样品稀释液：1×20ml。
 

　　4、 检测稀释液A：1×10ml。
 

　　5、 检测稀释液B：1×10ml。
 

　　注意事项：
 

　　1.基础程序；
 

　　2.扩增温度和延伸温度；
 

　　3.反应时间；
 

　　4.循环次数；
 

　　5.PCR 反应液的配制；
 

　　6.PCR技术的基本原理；
 

　　7.PCR的反应动力学；
 

　　8.PCR扩增产物；
 

　　9.PCR反应体系与反应条件。
 

　　【储存条件及有效期】:
 

　　-20℃避光保存，避免反复冻融，有效期6个月。
 

　　【适用仪器】:
 

　　ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等荧光定量PCR仪。
 

　　【样本采集、存放及运输】
 

　　u 样本采集：各类型样本按照常规方法采集；
 

　　u 存放：样本在2~8℃条件下保存应不超过72h，-70℃以下可*保存，但应避免反复冻融(多冻融3次)；
 

　　u 运输：采用泡沫箱加冰密封进行运输。
 

　　【自备试剂】:产品仅用于科研实验