Omega去内毒素质粒提取试剂盒操作说明
- 发布时间：2020-03-24
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| 资料类型 | docx文件 | ||
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| 上 传 人 | 上海古朵生物科技有限公司 | ||
| 关 键 词 | Omega,质粒DNA试剂盒 | ||
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该试剂盒用于从克隆菌中大量提取去除内毒素的高品质质粒，一般来说可从200ml过夜培养的菌液中提取高拷贝质粒600-1200ug，低拷贝质粒50-400ug。试剂盒自带的说明书为英文说明书，不是非常方便阅读，所以本文根据英文原版重新翻译了一遍，希望对大家有帮助。
实验前准备
1. 使用前,将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。
2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer，并于室温保存。
试剂盒型号 加入的乙醇量(ml)
D6926-00B 60
D6926-01B 160
D6926-03B 200
D6926-04B 200每瓶
细菌的培养：
1. 在容积为1-4升的培养瓶中加入200ml含筛选抗生素的LB培养基，加入含目的质粒的克隆菌(一般为1/1000比例接种，也即200ul)，然后置37℃振荡培养12-16小时。为了获得*的效果，*接菌使用经过夜培养活化的菌种。对于大多数质粒的提取，我们强烈*使用endA阴性的菌种，比如DH5α和JM109。
*的培养条件对于质粒DNA的得率至关重要。*的培养条件包括，首先由新转化或新划线的培养板中挑取单个克隆，然后接种于2-5ml含合适筛选抗生素的培养基中，37℃振荡(摇床转速设定在约300rpm为宜)培养约8小时；然后继续接种于含抗生素的预热的液体培养基中，37℃振荡(~300rpm)培养12-16小时。盛培养基的容器的容积需至少为培养基体积的3-4倍(注：保证培养环境中有足够的氧气，防止厌氧菌的繁殖)，初始培养基接种的稀释比例为1/500到1/1000为宜。
为了获得*的效果，我们*每次培养后测定OD600值。对于过夜培养活化的细菌而言，OD600的值处于1.5-2.0之间是细菌生长良好的指标。在测定OD600时，为了保证测量值处于光度计测量的线性范围(0.1-0.5)，需将培养物进行必要的稀释(10到20倍)。当接种进行大量培养时，我们*细菌的终密度在2.0-3.0之间为宜。当使用富营养的培养基，需要注意保证细菌的密度不要超过OD600为3.0；如果使用冻存的甘油菌，需要首*行划线并挑取单克隆，然后和前面一样进行必要的活化。
富营养培养基如2xYT或TB，不*使用本试剂盒。
碱性-SDS溶液裂解细菌：
2. 取100-200ml菌液3,500-5,000xg室温离心10min收集菌体沉淀。
3. 小心去除上清液，为了保证所有上清去除*，可使用干净的纸巾将容器壁上液滴吸除，加10ml Solution Ⅰ/RNase A , 涡旋或用移液枪上下吹打重悬菌体，重悬*对于获得zui高的得率至关重要;
4. 加10ml SolutionⅡ，来回颠倒10-15次轻柔混匀，以得到澄清的裂解液。如有必要可室温孵育2min。
避免混合时动作过于剧烈，过于剧烈会剪切细菌的染色体DNA(从而在接下来的步骤中不能被充分沉淀)并且导致质粒的纯度降低。(当Solution II在不使用时，需要将瓶盖旋紧，防止空气中的CO2与Solution II反应生成碳酸盐)
5. 加5ml Buffer N3，轻轻颠倒充分混匀几次直至白色絮状沉淀出现。室温放置2—3min，期间偶尔颠倒混合，以使其充分反应。
注意：该溶液必须充分混合。如果混合物依然非常的粘滞，呈褐色并且成团状，则需要进一步混合以充分中和该溶液，充分中和对于获得更好的得率至关重要。使用冰预冷的Buffer N3将有利于沉淀更多的细菌蛋白。
6. 准备结合柱：加5ml的Buffer GPS至结合柱中，室温放置3—10min，3,000—5,000×g室温离心5min，弃滤液(注：这里中文说明书中添加了一步“往柱子里加入10ml无菌水离心弃滤液”，而在英文原版中是没有的)，把柱子插回50ml收集管中。(注：这里可以使用一个旧的50ml离心管收集废液，而将试剂盒中附带的新离心管用于zui后一步质粒洗脱时使用)。
使用针筒式过滤器过滤裂解物：
7. 将第5步得到的裂解液及沉淀物全部转移至针筒式过滤器中，准备一个干净的50ml离心管收集滤液。将过滤器的活塞插回针筒。
8. 将针筒对准50ml收集管，轻轻推动活塞，收集澄清的滤液。一些裂解液中可能仍然残留有絮状沉淀物，不要强行将这些残留的裂解液推挤过柱。
9. 加入等体积的ETR Binding Buffer(~25ml)到结合柱上，上下反复颠倒7-10次。
使用HiBind结合柱纯化质粒DNA(注：离心法，适用于同时抽提多个样品，对于样本量较少时，*使用后面的真空抽滤法)
10. 小心转移裂解液至HiBind结合柱，3,000—5,000×g离心3—5min,使液体滤过柱子，弃滤液。
11. 重复步骤10，直至所有裂解液都过滤完，弃滤液。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到结合柱上，3,000—5,000×g离心3—5min,使全部液体滤过柱子，弃滤液。
13. 加入10ml Buffer EHB到结合柱上，3,000—5,000×g离心3—5min使全部液体滤过柱子，弃滤液。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer(预先添加了乙醇)到结合柱上，3,000—5,000×g离心3—5min使全部液体滤过柱子，弃滤液；
注意：试剂盒附带的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释。如果试剂是低温保存的，使用前需要预先恢复温度至室温。
15. 加入10ml DNA Wash Buffer到结合柱上3,000—5,000×g离心3—5min使全部液体滤过柱子，弃滤液；
16. 把空柱子套回离心管，zui大转速(不超过6,000×g)离心10—15min使柱子充分干燥。不要跳过该步骤-该步对于去除柱子中残留的乙醇非常关键。
使用HiBind结合柱纯化质粒DNA(注：真空抽滤法，对于样品个数较少时，该方法比较节省时间)
10. 安装好抽滤装置，将结合柱与抽滤瓶密闭结合
11. 转移裂解液至HiBind结合柱，使液体全部滤过柱子。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到结合柱上，洗涤一次(注：流速可能会比较慢)。
13. 加入10ml Buffer EHB到结合柱上，洗涤一次。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer(预先添加了乙醇)到结合柱上，洗涤一次。
15. 再次加入10ml DNA Wash Buffer，洗涤一次。
16. 继续抽真空10-15min，以充分干燥结合柱(注：当抽提多个样品时，可以选择离心法步骤16中的方法以节约时间)。
由结合柱洗脱质粒DNA(常规方法，也可以使用后面介绍的另一种洗脱方法)
17. 进一步干燥柱子：选择以下任一种方法在洗脱前进一步干燥结合柱
A. 将结合柱转移真空抽滤装置上室温抽滤15min
B. 将结合柱放入65℃恒温烤箱，烘烤10—15min
18. 把结合柱套在一个新的50ml离心管中(注：可以使用试剂盒附带的离心管)，加入1—3ml(注：依据要求的质粒终浓度，可以分步两次洗脱，第1次少量洗脱保证得到高浓度的质粒，第二次稍加大洗脱体积，保证尽可能将质粒洗脱*) Endotoxin-Free Elution Buffer(或去离子水)至结合柱的膜上，室温放置2—5min，以zui高转速离心(不超过6,000xg)5min洗脱质粒DNA。
上面描述的方法可以回收大约60-80%柱结合的DNA。也可以选择进行二次洗脱从而将所有残留的DNA全部回收，但二次洗脱的DNA浓度会低一些。另外，第二次洗脱也可以使用*洗脱下来的液体以保证得到较高浓度的质粒DNA。将洗脱液或去离子水预热至70℃并且在洗脱前，室温放置2min，可能会显著提升zui终的得率。
注意：使用该方法得到的质粒可以很好的应用与PCR，限制性酶切，脂质体转染等。预期的质粒浓度可能依据质粒的拷贝数不同存在一些出入。但是，一般来说高拷贝的质粒终浓度在150-600ug/ml。该方法得到的质粒可能会包含一些乙醇残留，但一般不会影响下游实验。如果需要获得更高的质粒浓度和*去除乙醇残留，可以选择使用下面的方法。
另一种结合柱洗脱质粒DNA的方法
1. 把结合柱套在一个新的50ml离心管中(注：可以使用试剂盒附带的离心管)，加入6ml Endotoxin-Free Elution Buffer(或去离子水)至结合柱的膜上，室温放置2min，以zui高转速离心(不超过6,000xg)5min以洗脱质粒DNA。将洗脱液或去离子水预热至70℃并且在洗脱前，室温放置2min，可能会显著提升zui终的得率。
2. 将洗脱的质粒DNA转移到一个干净的适用于沉淀的离心管中。加入260ul 5M NaCl以及4.4ml室温放置的异丙醇。涡旋以充分混匀，然后以不低于15,000×g转速4℃离心30min。小心地去除上清。
3. 用2ml 70%的乙醇洗涤沉淀一次，以不低于15,000×g转速4℃离心10min，小心地去除上清。空气干燥沉淀5-10min。
4. 加入200-500ul(依据要求的质粒终浓度)Endotoxin-Free Eluiton Buffer或去离子水重悬DNA。
