哺乳动物细胞表达的难点和解决方案
- 发布时间：2019/7/11 9:53:48
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我们将着重介绍 Strep-tag® 在哺乳类细胞表达系统的应用。
虽然大肠杆菌 E.coli 表达系统经济实惠，但由于缺乏重要的脂类，分子螫合物，以及重要的翻译后修饰，用它表达真核蛋白，可能会影响蛋白本身的折叠及功能，以膜蛋白为例，大肠杆菌表达系统能影响目标蛋白在细胞膜的插入位置、及其应有的功能[1]。除此之外，当目标蛋白大于 50kDa 时，使用大肠杆菌系统可能表达出不完整的蛋白[2]。
所以，为了研究特定蛋白的功能（如：信号通路）、生产较大型的蛋白，或进行高解析度的结构分析，愈来愈多的实验组选择哺乳类表达系统来生产融合蛋白。其原因为哺乳动物细胞生产出的重组蛋白与人类蛋白十分相似，有较完整的蛋白折叠、组合及翻译后修饰[3]。因此，愈来愈多科学家们更加关注于—如何从哺乳类细胞中的纯化目标蛋白。
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亲和标签的选择
首先，需考虑选择合适的亲和标签。常用于哺乳动物表达系统的亲和标签有 His-tag、FLAG-tag、GST-tag及 Strep-tag® 等[4-12]，整理于下表：
（点击放大查看）
这些亲和标签在使用上各有千秋。
使用 His-tag 时，常遇到的问题是寄主蛋白与填料的非特异性结合，在哺乳动物重组蛋白的纯化过程中，这样的情况更为明显。由于系统中有很多含有*（histidine）的残基的蛋白，这种蛋白结构与 his-tag 相似，容易与镍柱结合，因此导致目标蛋白纯度降低[13]。
FLAG-tag 系统可在非变性条件下进行纯化，能得到高纯度、有活性的蛋白，但其缺点为纯化介质较为不稳定，且纯化成本高上许多[5]。
另一常用的标签为 GST-tag，一个 26kDa 的蛋白，其特点是表达量高，具高度抗原性，常用来增加目标蛋白的溶解度，但常常会影响目标蛋白的特性，一般推荐纯化后将标签去除[8]。
而 Strep-tag®（包含 Strep-tag®II或是 Twin-Strep-tag®），都是短肽标签，分别为 8 或 28 个胺基酸，一般不干扰蛋白折叠或活性，因此适合用于蛋白功能性研究[5]。Strep-tag® 可以特异性的结合在 Strep-Tactin® (二代介质) 或 Strep-Tactin®XT (三代介质) 的*的结合位点。洗脱时使用的脱硫*（适用于二代）或*（三代），对同样的结合位点有更高的亲和力，能将目标蛋白从同样位置移除，因此得到的目标蛋白纯度一般高于 95%[12]。
同时，三代 Strep-Tactin®XT 与 Strep-tag® 蛋白的亲和力大幅提升，直接加入含目标蛋白的哺乳细胞的培养上清，即可纯化出所需蛋白（注: 原本使用二代需先以 Avidin 或是 BioLock 将培养基中的*遮蔽，才不会影响纯化表现）。
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三代 Strep-Tactin®XT 亲和力显著
图 A 比较了 His-tag 与 Strep-tag® 直接加入哺乳细胞培养上清的纯化目标蛋白的表现。
图 A
图 A：分别向 Strep-Tactin®XT High Capacity 1ml 重力柱（左）和 Ni-NTA 1ml 重力柱（右）中，同时加入含 4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST) 或 mCherry-His-tag (His) 萤光蛋白的 ExpiCHO 细胞培养上清（注: 接下来的实验皆是取哺乳细胞表达某抗体后的上清，另加入高纯度目标蛋白进行实验)。由图可见，Strep-Tactin®XT（左）能率的捕捉 mCherry-TST，而右方的 mCherry-His 几乎无法挂柱。
此外，我们也测试了其他的蛋白，例如 SEAP (72 kDa) 或抗体 (mAb，其重链为 55 kDa)。图 B 为以 Strep-Tactin®XT 纯化 SEAP-TST、mCherry-TST与 mAb-TST 的 SDS-PAGE 分析结果，可见对于不同蛋白，Strep-tag® 系统都能纯化出高纯度的目标蛋白。(注: 红色标记处为 mCherry 的降解产物，非杂带)
图 B
因 Strep-Tactin®XT 与 Twin-Strep-tag 蛋白的高亲和力，即使目标蛋白的浓度低，使用 Strep-Tactin®XT 仍可以有效的捕捉上清中的目标蛋白。表 C 整理了几个实验的数据，显示当目标蛋白浓度低于 20 μl/ml 时，得率仍能达到几近 100%。
表 C
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Strep-Tactin®XT 普适性高
除了上述实验所用的 CHO 细胞株外（中国仓鼠卵巢细胞），另一常用于生产蛋白的哺乳动物细胞株为 HEK293(人胚胎肾细胞)，使用上较 CHO 简单。我们测试了 Strep-Tactin®XT 的纯化表现 : 表 D1 为以 Expi293 表达 SEAP-TST 或 mCherry-TST 蛋白后，目标蛋白的浓度。图 D2 为纯化表现的 SDS-PAGE 分析。从中可知，与 ExpiCHO 培养基相同，直接将表达好的 Expi293 上清加入 1 ml Strep-Tactin®XT 高载量重力柱中进行纯化，一样能够快速的得到高纯度的目标蛋白。
表 D1
图 D2
综上所述，Strep-tag® 非常适合用在哺乳动物细胞系中表达目标蛋白，其纯化过程也与常见的 ExpiCHO 及 Expi293 培养基相容，不须另外处理，让实验流程更为便利。加上 Strep-tag® 系统在纯度上的优势，是目前在这个应用上的选择。
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