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　　养细胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顾小孩一样仔细对待，爱护她，呵护她。如果你照顾的时候能注意这些问题，会让你的细胞养的更好。下面就将养细胞的注意事项跟大家交流一下。
 

　　1
 

　　冷冻管应如何解冻？
 

　　取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管的爆裂。
 

　　2
 

　　细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？
 

　　除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)，在解冻之后，应直接放入含有 10~15 ml 新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
 

　　3
 

　　可否使用与原先培养条件不同的培养基？
 

　　不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
 

　　4
 

　　可否使用与原先培养条件不同的血清种类？
 

　　不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
 

　　5
 

　　何谓 FBS，FCS，CS，HS？
 

　　FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 是错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。
 

　　6
 

　　培养细胞时应使用 5% 或 10% CO2？或根本没有影响？
 

　　一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统，而培养基中 NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时，细胞培养时应使用 10% CO2；当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5 g 时，则应使用 5% CO2 培养细胞。
 

　　7
 

　　何时须更换培养基？培养基中是否须添加抗生素？
 

　　视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。
 

　　除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。
 

　　8
 

　　附着性细胞继代时所使用的 trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
 

　　一般使用的 trypsin-EDTA 浓度为 0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 –20 ℃，避免反复冷冻解冻造成 trypsin 的活性降低，并可减少污染的机会。
 

　　9
 

　　悬浮性细胞应如何继代处理？
 

　　一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部分含细胞的培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。
 

　　10
 

　　欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
 

　　欲回收动物细胞，其离心速率一般为 1 000 rpm，5~10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。
 

　　11
 

　　细胞的接种密度为何？
 

　　依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原因之一。
 

　　12
 

　　细胞冷冻培养基的成分为何？
 

　　动物细胞冷冻保存时常使用的冷冻培养基是含 5~10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90~95 % 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将 DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。
 

　　13
 

　　DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何？
 

　　冷冻保存使用的 DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 的 DMSO (如 Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4 ℃，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 的裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤 DMSO，则须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。
 

　　14
 

　　冷冻保存细胞的方法？欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
 

　　冷冻保存方法一：冷冻管置于 4 ℃ 30~60 分钟 →(-20 ℃ 30 分钟) → -80 ℃ 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽 vapor phase 长期储存。
 

　　冷冻保存方法二： 冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。–20 ℃ 不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。
 

　　冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。
 

　　15
 

　　如何避免细胞污染？发生微生物污染时应如何处理？
 

　　细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的方法。
 

　　如果细胞发生微生物污染，加入相应抗生素，直接灭菌后丢弃。
 

　　16
 

　　支原体 （mycoplasma）污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？对细胞培养有何影响？
 

　　不能以肉眼观察出异状。除极有经验的专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨。
 

　　支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数，代谢及研究任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果的数据方有意义。
 

　　侦测出细胞株有支原体污染时，应直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
 

　　17
 

　　为何培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，颜色会偏暗红色，且 pH 值会越来越偏碱性？
 

　　培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，培养基内的 CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性，而培养基中的酸碱指示剂 (通常为 phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤 CO2，以调整 pH 值。
 

　　18
 

　　各种细胞培养用的 dish，flask 是否均相同？
 

　　不同厂牌的 dish 或 flask，其所 coating 的 polymer 不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大的影响，唯有少数细胞则可能因使用厂牌不同， dish 或 flask 有生长差异。
 

　　19
 

　　购买的细胞死亡或存活率不佳可能原因？细胞冷冻管解冻后，为何会有细胞数目太少的情形？
 

　　研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；细胞置于 –80 ℃ 太久。
 

　　研究人员在冷冻细胞培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
 

　　20
 

　　收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？
 

　　冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用*小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，是因热胀冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
 

　　21
 

　　如何选用特殊细胞系培养基？
 

　　培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同样很容易生长。总之，首xuan MEM 做粘附细胞培养，RPMI-1640 做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养首xuan AIM V(12005)培养基(SFM)。
 

　　22
 

　　L-*在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
 

　　L-*在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-*可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-*在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有终定论。L-*的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
 

　　23
 

　　GlutaMAX-I 是什么？培养细胞如何利用 GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
 

　　GlutaMAX-I 二肽是一个 L-*的衍生物，其不稳定的 alpha-氨基用 L-*来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放 L-*供利用。GlutaMAX-I 二肽非常稳定，即使在 121 磅灭菌 20 分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有小的降解，如果在相同条件下，L-*几乎*降解。
 

　　24
 

　　什么培养基中可以省去加酚红？培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
 

　　酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
 

　　丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
 

　　25
 

　　为什么目录上说 Hank's * （HBS） 在空气中使用，不需要 CO2 培养箱？HBS 和 Earle's * （EBS） 有什么本质的功能差别？
 

　　HBS 和 EBS 的主要差别在于*的水平，在 Eagles (2.2 g/L) 中比在 Hanks (0.35 g/L) 中高。*需用高水平的 CO2 平衡，以维持溶液的 PH 值。Eagles 液在空气水平的 CO2 中，溶液会变碱，Hanks 液在 CO2 培养箱中会变酸。如果希望在 CO2 培养箱中保存组织，需要用 Eagles 液，如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用 Hanks 液就可以了。
 

　　26
 

　　二价离子抑制*活性吗？使用*时加入 EDTA 的目的是什么？
 

　　二价离子的确抑制*活性。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制*的活性。建议*处理细胞前，用 EDTA 清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
 

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　　其他注意事项
 

　　当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的 50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。
 

　　一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。
 

　　大部分添加物和试剂多可以冻融 3 次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。
 

　　在溶解的一周内使用贮存在 4℃ 冰箱中的液体*溶液。*在 4℃ 就可能开始降解，如果在室温下放置超过 30 分钟，就会变得不稳定。
 

　　为了保持 CO2 培养箱水盘清洁，需定期 (至少每两周一次) 用无菌蒸馏水或无菌去离子水更换。