微生物的实验室培养
- 发布时间：2019/3/14 14:53:45
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1. 培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。
2. 常见的培养基包括：液体状态的液体培养基，可用于工业生产；添加了凝固剂(如琼脂)的固体培养基，常用于微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏等，微生物在固体培养基表面生长可形成肉眼可见的菌落。
3. 培养基一般都含有水、碳源(包括无机碳源如CO2、有机碳源如葡萄糖)、氮源(包括无机氮源如NH3、有机氮源如蛋白质)和无机盐。
4. 培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质(即生长因子)以及氧气的要求。
5. 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。
6. 消毒是使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)；灭菌是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。
7. 常用的消毒方法：煮沸消毒法(在100 ℃煮沸5～6 min)，日常生活中常用于一般物品的消毒；巴氏消毒法用水浴锅操作(在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min)，用于一些不耐高温的液体，如牛奶的消毒；化学药剂消毒法，如用酒精擦拭双手、用Cl?消毒水源等；紫外线消毒法(紫外灯照射30 min)，用于接种室、操作台的表面灭菌和空气灭菌。
8. 常用的灭菌方法：灼烧灭菌(酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧)，用于接种工具或其他金属用具的灭菌和试管口或瓶口的灭菌；干热灭菌(在干热灭菌箱内160～170 ℃加热1～2 h)，用于玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属工具等的灭菌；高压蒸汽灭菌(在高压蒸汽灭菌锅内压力为100 kPa，温度为121 ℃的条件下15～30 min)，用于培养基及容器的灭菌。
9. 制作牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤：①计算各成分的用量；②称量，注意要使用称量纸、动作要迅速、称后及时盖瓶盖；③溶化，注意将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶入水中；④灭菌，将培养基转移至锥形瓶，加棉塞，包上牛皮纸，在高压蒸汽灭菌锅内灭菌15~30min，将5~8套培养皿用几层报纸包紧作一包，在干热灭菌箱内灭菌2h；⑤倒平板，培养基50℃左右时在酒精灯火焰附近操作。
10. 倒平板时要注意：全程在酒精灯火焰附近操作；锥形瓶的瓶口通过火焰灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基；培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙即可；等待平板冷却凝固(大约需5～10min)后，将平板倒过来放置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
11. 菌落是单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，形成的肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。
12. 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，终分离得到单菌落。
13. 接种环的灼烧：①划线前：消灭接种环上的微生物，避免污染培养物；②每次划线前：杀死接种环上的残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端；③划线结束后：杀死接种环上的残留菌种，避免污染环境和感染操作者。
14. 灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免接种环温度太高杀死菌种。
15. 第二次划线以及其后的划线操作，要从上一次划线的末端开始划线，使细菌的数目随着划线的次数增加而逐步减少，终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
16. 稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个的菌落。其主要操作步骤包括系列稀释操作和涂布平板操作。
17. 稀释涂布平板法操作时，应注意以下操作以防止杂菌污染：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处；涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃；移液管管头不要接触任何物体。
18. 稀释涂布平板法可用于微生物计数，但需涂布多个平板，操作较复杂。
19. 未接种的培养基可作为空白对照，若其在恒温箱保温1~2d后无菌落生长，说明培养基的制作是成功的，否则需要重新制备。
20. 若接种成功，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。
21. 对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的低温培养箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。
22. 菌种的临时保藏方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。
23. 对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在-20℃的低温培养箱中保存。
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